病毒性心肌炎儿童112例血浆外泌体微小RNA-148a水平的观察

郑瑞利，冯迎军，杨慧敏，王芳洁，何坤

病毒性心肌炎（VMC）是一种常见病毒感染相关性心肌疾病，其中以柯萨奇病毒B较多见，可发生于各年龄阶段，但多见于学龄前及学龄期儿童［1］。病儿临床表现不一，多数经适当治疗后可痊愈，少数病儿病情进展，可导致心律失常、心力衰竭甚至猝死，严重影响病儿身心健康并给其家庭带来严重伤害［2］。目前尚缺乏特异、敏感单一快速诊断指标，临床确诊VMC 金标准仍为心内膜活检，因其有创性，活检难度及风险较大，临床应用受限，而心电图、临床症状及实验室相关指标等准确性差，一定程度影响临床治疗及预后判断，易延误病情［3］。研究报道，血液外泌体与柯萨奇B 病毒引起的VMC 发生发展密切相关［4］。微小RNA（miRNA，miR）是一种非编码RNA，在外泌体中表达丰度比组织中高很多，且miRNA 可被包裹在外泌体中运输，发挥对其靶基因转录后调控作用，研究报道miR-381、miR-133b 等多种miRNA 可参与心肌炎发生发展［5-6］。有研究报道，miR-148a 与骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化作用机制有关［7］，但关于miR-148a 与VMC 的关系研究尚不多见。因此本研究拟通过检测血浆外泌体miR-148a 水平，探究其对VMC 的诊断价值，以期为临床VMC 快速诊断提供一定参考。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2017 年9 月至2019 年6 月郑州大学附属儿童医院收治的VMC 病儿112 例纳入研究组。住院时间（23.67±5.32）d；治愈63 例，有效36 例，无效13 例，总有效率88.39%；年龄（9.12±2.24）岁，范围为2～14 岁；男66 例，女46 例。纳入标准：（1）均符合中华医学会儿科学分会心血管学组和中华儿科杂志编辑委员会制定的《病毒性心肌炎诊断标准（修订草案）》［8］；（2）年龄不超过14 岁；（3）临床资料完整。另选取同期门诊健康体检正常儿童112 例为对照组，年龄（9.06±2.15）岁，范围为2～13 岁；男62 例，女50 例。两组病儿年龄、性别比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。排除标准：（1）合并先天性心脏病者；（2）合并恶性肿瘤者；（3）合并严重肝、肺、肾等重要脏器功能障碍者；（4）合并血液传染性疾病或自身免疫性疾病者。收集所有受试者临床检查资料，所有样品采集及资料调查均取得病儿或其监护人知情同意并签字确认，本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 主要试剂及仪器Exosome Isolation Reagent（货号EX010）购自上海歌凡生物科技有限公司；Trizol 试剂（货号R0016）购自上海碧云天科技有限公司；miRNA 提取试剂盒（货号AM1561）、人心肌肌钙蛋白I（cTnI）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（货号MA1-20117）均购自美国Invitrogen；Prime-Script ™Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit（货 号6210A）、Mir-X miRNA qRT-PCR SYBR Kit（货 号638314）均购自TaKaRa 生物公司；检测超敏C 反应蛋白（hs-CRP）试剂盒（50人份/盒，批号20122401706，武汉明德生物科技股份有限公司）。引物由华大基因合成。FC 型酶标仪购自美国Thermo Fisher 公司；7500 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）仪购自美国Bio-Rad公司等。

1.3 方法

1.3.1 提取血浆外泌体 于VMC 病儿确诊1 周内，采集病儿及同期受试儿童晨起空腹外周静脉血5 mL，并于1 h 内3 000 r/min 离心10 min，有效离心半径10 cm，留取血浆。采用外泌体分离试剂盒分离血浆中外泌体，具体操作严格按照试剂盒说明书进行。并于透射电镜下鉴定外泌体形态。

1.3.2 检测血浆外泌体miR-148a 水平 取50 μL外泌体样本，采用Trizol 提取血浆外泌体总RNA，浓度及纯度检验合格（吸光度280nm/吸光度260 nm约1.8～2.0）后，逆转录得互补DNA（cDNA）。采用RT-qPCR仪对miR-148a 进行扩增。miR-148a 正向引物序列（5′ →3′） ：ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCACTACAGAA，反 向 引 物 序 列（5′→3′）：CACAGCTCGTAGAACAGGAGG。内参U6 正向引物序列（5′→3′）：GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT，反向引物序列（5′→3′）：CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT。反应体系（25 μL）：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（2X）12.5 μL，cDNA（50 mg/L）2 μL，正反向引物（10 μmol/L）各1 μL，双蒸水8.5 μL。反应条件：95 ℃，5 s；95 ℃，30 s；60 ℃，30 s；72 ℃，15 s；40 个循环；添加溶解曲线。采用2-ΔΔCt法定量分析血浆外泌体miR-148a 相对表达水平。

1.3.3 检测血浆cTnI、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、hs-CRP水平 采用ELISA检测病儿血浆cTnI水平，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。采用DXC600全自动生化仪检测血浆CK-MB水平。采用荧光免疫层析法检测血浆hs-CRP 水平（50 人份/盒，批号20122401706，武汉明德生物科技股份有限公司）。血浆CK-MB 正常参考范围：0～25 U/L，cTnI 正常参考范围：0～0.2 μg/L。

1.4 统计学方法采用SPSS 22.0 进行统计学分析。计数资料以例（%）表示，采用χ2检验；计量资料均符合正态分布以± s表示，两组间比较行两独立样本t检验。采用Pearson相关性分析检验血浆外泌体miR-148a 与血浆cTnI、CK-MB、hs-CRP 水平的相关性。绘制受试者工作特征曲线（ROC 曲线），组间ROC 曲线下面积（AUC）比较行Z 检验，根据AUC比较血浆外泌体miR-148a、cTnI、CK-MB、hs-CRP 水平对VMC 的诊断价值。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血浆外泌体鉴定分离得到血浆外泌体在透射电镜下呈大小不等、直径约100 nm 典型圆形或椭圆形囊泡结构，见图1。

图1 透射电镜下血浆外泌体形态

2.2 研究组与对照组儿童血浆外泌体miR-148a 水平比较研究组病儿血浆外泌体miR-148a 相对表达水平为（5.34±1.06），高于对照组（1.01±0.12）（t=42.96，P＜0.001）。

2.3 研究组与对照组儿童血浆cTnI、CK-MB、hs-CRP 水平比较与对照组比较，研究组病儿血浆cTnI、CK-MB、hs-CRP 水 平 均 升 高（P＜0.05），见表1。

表1 两组儿童血浆cTnI、CK-MB、hs-CRP水平比较/± s

表1 两组儿童血浆cTnI、CK-MB、hs-CRP水平比较/± s

注：cTnI 为心肌肌钙蛋白I，CK-MB 为肌酸激酶同工酶，hs-CRP为超敏C反应蛋白。

组别对照组研究组t值P值例数112 112 cTnI/（μg/L）0.07±0.02 0.56±0.13 39.43＜0.001 CK-MB/（U/L）42.01±5.36 106.13±17.82 36.47＜0.001 hs-CRP/（mg/L）1.16±0.21 5.19±1.02 40.95＜0.001

2.4 VMC 病儿血浆外泌体miR-148a与血浆cTnI、CK-MB、hs-CRP 水平的相关性Pearson 相关性分析结果显示，VMC病儿血浆外泌体miR-148a与血浆cTnI、CK-MB、hs-CRP水平均呈正相关（r=0.62、0.64、0.49，均P＜0.001）。

2.5 血浆外泌体miR-148a 及血浆cTnI、CK-MB、hs-CRP 水平对VMC 的诊断价值比较血浆外泌体miR-148a 与血浆cTnI 诊断早期VMC 的效能一致，均优于血浆CK-MB、hs-CRP，见表2。

表2 血浆外泌体miR-148a及血浆cTnI、CK-MB、hs-CRP水平对VMC的诊断价值比较

3 讨论

以往研究多以血清标本为载体筛选VMC 诊断生物标志物，但由于血清蛋白含量丰富，易造成干扰，降低效率［9-10］。而因病儿心肌活检组织不易获取，在临床早期VMC诊断中严重受限。本研究采用血浆外泌体为检测标本，外泌体是一种直径约50～150 nm 的囊泡结构，大小不等，主要内容物为miRNA、mRNA 及蛋白质等，成分相对简单，其内部成分及其分泌细胞来源与病理生理状态有关［11-12］。赵宗磊等［4］在VMC 病人血浆外泌体中成功筛选10 个VMC 相关差异蛋白，其中视黄醇结合蛋白4 有潜力成为VMC早期筛查特异性生物标志，提示血浆外泌体在VMC 发病机理中扮演重要角色。本研究结果发现，与对照组比较，研究组血浆外泌体miR-148a表达水平升高。miRNA 在进化过程中序列高度保守，其在外泌体中表达丰度显著高于组织及循环miRNA，外泌体来源miRNA 相对稳定不易被RNA酶降解，且与VMC 炎症、免疫过程密切相关［13］。Fan等［14］研究报道，急性心肌炎血清外泌体miR-181a 和miR-30a 表 达 上 调，上 调miR-181a 和miR-30a 可 通过靶向抑制细胞因子信号转导抑制因子3 表达，促进白细胞介素-6 分泌，促进大鼠VMC 发生发展，相反抑制miR-181a 和miR-30a 可增加柯萨奇病毒B3诱导的VMC大鼠存活率。有研究报道，心肌活检组织miR-148a 和miR-155 在急性VMC 病人中上调，miR-148a 可与miR-155 协同靶向抑制急性VMC 中核因子-κB 通路来减少柯萨奇病毒B3 诱导的VMC大鼠心脏损伤［15］。综合以上研究及本研究结果提示血浆外泌体miR-148a 水平升高可能与小儿VMC发生有关。

近年来小儿VMC 发病率呈逐渐上升趋势，因缺乏特异性检测指标，易造成重症VMC 病儿误诊、漏诊，导致病情进展恶化、甚至猝死，给病儿及其家属造成严重伤害。因此急需寻找小儿VMC 早期诊断的简单、无创、敏感、特异生物指标。目前临床多采用等心肌酶谱、炎性指标等相关指标辅助VMC早期诊断，但灵敏度或特异性低，影响诊断的准确性［16-17］。本研究亦对临床常用cTnI、CK-MB、hs-CRP指标进行检测，结果发现，与对照组比较，研究组病儿血浆cTnI、CK-MB、hs-CRP 水平均升高，且与血浆外泌体miR-148a 均呈正相关。cTnI、CK-MB 在正常机体外周血含量极少，特异存在于心肌细胞中，心肌损伤时可释放入血使血浆含量增加，是心肌损伤的标志性蛋白［18-19］。hs-CRP是一种常见急性炎症反应蛋白，机体发生感染或损伤时，水平升高［20］。以上提示血浆外泌体miR-148a 水平升高可能与血浆cTnI、CK-MB、hs-CRP 水平升高有关，协同影响VMC发生发展及心肌损伤。本研究进一步进行ROC 分析发现，血浆外泌体miR-148a 及血浆cTnI、CK-MB、hs-CRP 水平对VMC 早期诊断的AUC 分别为0.94、0.94、0.83、0.86，其中miR-148a 与cTnI 一致，优于血浆CK-MB、hs-CRP，提示血浆外泌体miR-148a 对小儿VMC 诊断有较高参考价值，可能成为诊断早期VMC的生物标志分子。

综上所述，血浆外泌体miR-148a 在小儿VMC中表达水平上调，可能对小儿早期VMC有一定诊断价值，有潜力成为早期VMC 诊断的生物标志分子。但由于本研究仅为单中心研究，所纳入的样本量偏少，可能造成结果存在局限性，且关于miR-148a 诊断早期小儿VMC 的最佳阈值有待进一步验证。因此，后期应加大样本量进行多中心深入探究。