2株嗜热脂肪芽孢杆菌的基因组和耐药性分析

吕 涛，孙志文，李 倩，毕言锋，朱 奎

(1. 北京市兽药监察所，北京 大兴 102629 ; 2. 中国农业大学动物医学院，北京 海淀 100193 ;3. 北京英太格瑞检测技术有限公司，北京 海淀 100095)

近年来，随着人们对动物源食品安全关注度逐步提高，兽药残留检测技术也飞速发展，高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法和酶联免疫吸附法等都是常用的特异性强且灵敏度高的检测方法。微生物抑制药物残留检测方法对设备的要求比较低，且检测成本较低，适用于对大批量样本进行同时检测。嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus,previouslyBacillusstearothermophilus)由于其培养条件稳定并且对多种抗生素敏感度较高，是被美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)认可的、国际公认的最常用的抗生素残留检测指示菌株。国标 GB/T 4789.27—2008中规定了2种检测鲜乳中抗生素残留的方法，嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法是其中之一[1-2]。此外，嗜热脂肪芽孢杆菌由于其所产芽孢对压力蒸汽抵抗力在大多微生物之上，被欧洲、美国等国家的药典作为热力灭菌生物指示剂的标准菌株[3-4]。我国卫生部也将该菌株作为压力蒸汽灭菌效果标准检测菌株列入《消毒与灭菌效果的评价方法与标准》(GB 15981—1995)。近年来，随着对嗜热芽孢杆菌的关注度越来越高，人们对其基因组研究也逐渐深入。已有研究表明，通过全基因组测序分析可知嗜热芽孢杆菌中的次级代谢产物的种类，例如脂肽、多肽、脂肪酸、乳糖、聚合物、聚酮化合物、异香豆素类等[5]。但有关嗜热脂肪芽孢杆菌中的质粒研究的较少，全基因组序列中蕴藏的信息还需要更深入地挖掘。

本试验以2株分离所得的嗜热脂肪芽孢杆菌为研究对象，基于基因组序列信息和耐药性分析，探究2株嗜热芽孢杆菌的生物特性，筛选可应用于兽药残留检测的核心菌株，以期进一步扩充此菌种的基因信息，为开发此类菌株提供数据支持及研究依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 PremixExTaqVersion 2.0 (Loading dye mix)，购自TaKaRa公司；GoodView核酸染料，购自北京赛百盛基因技术有限公司；标准菌株，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)；氨苄西林、头孢噻肟、链霉素、氯霉素、四环素、红霉素、庆大霉素、环丙沙星、万古霉素、磺胺甲噁唑等，均购自中国兽医药品监察所。

1.2 主要仪器 PCR扩增仪，美国ABI公司产品；电泳成套设备，美国Bio-Rad公司产品；凝胶成像系统，Alpha Innotech Corporation公司产品；超净工作台，苏州净化设备有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 16S rRNA基因序列分析 16S rRNA基因PCR扩增引物分别为27F:5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R:5′-TACGGTTACCTTGTTACGA-CTT-3′[6]。PCR反应体系：2×TaqMix 10 μL；27F引物 0.4 μL；1492R引物 0.4 μL；2株分离菌株DNA模板1 μL，阳性对照组加入1 μL标准菌株DNA模板，阴性对照组加入1 μL ddH2O，最后以ddH2O补足20 μL，进行PCR扩增。PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，共35个循环;之后72 ℃延伸10 min，扩增结束。PCR产物的纯化与测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。使用NCBI数据库中的Blastn工具，在GenBank中进行同源性序列检索，挑选同源性最近的基因序列，运用MEGA 7.0邻接法构建系统发育进化树。

1.3.2 全基因组测序及核心基因组进化树构建 使用细菌基因组提取试剂盒提取2株分离菌株的基因组DNA，使用NanoDrop对细菌基因组DNA浓度和质量进行检测。将提取的基因组送至北京赛默百合公司在Pacbio平台上进行三代测序。在NCBI数据库中检索并下载嗜热脂肪芽孢杆菌全基因组，使用Harvest工作包内的Parsnp(version v1.2)工具提取各分离株的核心基因组构建系统发生树。通过在线工具iTOL将构建的系统发生树进行可视化展示。

1.3.3 质粒序列分析 通过北京赛默百合公司Pacbio平台进行质粒测序，使用Snapgene软件构建质粒的标识图谱，使用Brig软件对菌株携带的质粒以及NCBI上下载的报道过的同种属的质粒进行比对，标注开放阅读框的功能。

1.3.4 药物敏感性试验 采用美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laborary Standards Institute,CLSI)推荐的K-B纸片扩散法对芽孢杆菌临床常见的10种抗菌药物进行抑菌活性测定。10种抗菌药物包括：氨苄西林、头孢噻肟、链霉素、氯霉素、四环素、红霉素、庆大霉素、环丙沙星、万古霉素、磺胺甲噁唑[7-8]。药敏试验质控菌株为金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)，判定标准主要依照《抗菌药物药敏纸片判断标准》“非高(苛)营养细菌金黄色葡萄球菌的敏感标准”。

2 结果

2.1 16S rRNA基因序列分析 现有的2株嗜热芽孢杆菌，1株分离于肾组织的抗生素残留检测测试KIS试管(Commercial isolate)，另1株为实验室保存菌株(CAU475)。为了鉴定2株分离菌株的种属，将分离菌株的16S rRNA进行测序并将序列提交至NCBI核酸数据库进行比对分析。运用MEGA 7.0软件，将8株不同嗜热芽孢菌属的16S rRNA序列与2株分离菌株的16S rRNA基因序列进行同源性对比，其系统发育进化树如图1所示，2株分离菌株与嗜热脂肪芽孢杆菌同源性较高，可以将其确定为嗜热脂肪芽孢杆菌。

2.2 核心基因组进化树分析 为进一步了解2株嗜热脂肪芽孢杆菌的生物特性，以及其与已报道菌株的亲缘关系，从NCBI中检索并下载4株嗜热脂肪芽孢杆菌的全基因组序列进行核心基因组进化树的构建，其中包括作为抗生素残留检测的标准指示菌株GeobacillusstearothermophilusATCC 7953[9]。结果如图2所示，Commercial isolate与G.stearothermophilusATCC 7953的同源性极高，与CAU475的同源性也较高，证明其可能具有相似的生物学特性。

图2 嗜热脂肪芽孢杆菌系统进化树

将G.stearothermophilusATCC 7953作为参考菌株，将Commercial isolate和CAU475全基因组进行相似度比较，结果如图3所示，Commercial isolate与ATCC 7953相似度为98.85%，与CAU475相似度也高达98.67%，其差异区域为第240～300位碱基，但差异区域的具体功能还有待进一步研究。

图3 分离菌株与参考菌株基因组相似度

2.3 质粒序列分析 将Commercial isolate和CAU475全基因组进行进一步分析发现，Commercial isolate中检测到1个45 kb大小的质粒，命名为pCOML。有关嗜热芽孢杆菌属基因组中质粒的研究相对染色体的研究较少，所以本试验对pCOML序列信息进行了比对和标注，以期丰富嗜热芽孢杆菌质粒序列信息数据库。pGS18质粒[10]来源于嗜热脂肪芽孢杆菌，全长63.8 kb，是NCBI收录的序列信息较全的质粒，以pGS18质粒序列作为参考，将pCOML质粒与之进行比对，数据的计算分析显示，pCOML全长44 814 bp，共有49个假定的开放阅读框架(Open reading frames,ORFs)，共占82.2%。39个ORFs(79.6%)被指定为假定功能；22个ORFs(44.8%)的氨基酸序列与其他微生物蛋白的相似性较高，如图4所示，介导质粒水平转移的转运蛋白(traC、topB、traG、mobA)、转录起始位点(repE)以及部分功能蛋白 (xerC、yxlF、yokF、soJ)与已报道的pGS18质粒相似度都在90%以上。

图4 质粒图谱及开放阅读框标注

2.4 药物敏感性试验 为探究野生菌株是否可用于抗菌药残留检测，选取了10种常见抗菌药，根据生物抑制法检测抗菌药残留的检测限，进行纸片法药敏试验。结果显示Commercial isolate和CAU475对绝大多数抗菌药都敏感(表1)，证明其可以用于抗菌药残留检测的指示菌株。

表1 抗菌药对嗜热脂肪芽孢杆菌的药敏试验

3 讨论

随着人们对动物源食品安全逐渐重视，微生物抑制法残留检测以其成本低及方法简便等优点被关注[9]。嗜热脂肪芽孢杆菌是良好的抗生素残留检测指示菌株，但目前能作为商品化使用的菌株数量有限。本试验分离得到2株嗜热芽孢杆菌分别为Commercial isolate和CAU475，经16S rRNA测序及序列进化树分析，这2株芽孢杆菌与嗜热脂肪芽孢杆菌的相似度为98.85%和98.67%。研究报道表明，G.stearothermophilusATCC 7953常作为抗菌药残留检测的标准指示菌株[11-12]。基因组的相似性一定程度上显示了生物学特性的相似性，本试验所得2株分离菌株与G.stearothermophilusATCC 7953的基因组同源性和相似度很高，说明其具有成为抗菌药残留检测候选菌株的潜力。为进一步探究其作为抗菌药残留检测菌株的可能性，本试验参考微生物抑制法的抗菌药残留检测标准，对分离菌株进行药物敏感性测试，结果发现分离菌株敏感性均低于检测限，且不携带任何毒力基因与耐药基因，与之前的报道一致[11]，符合生物抑制法的药物残留检测标准[7]，可作为候选菌株用于药物残留检测。

除此之外，Stuknyte等[10]曾在嗜热脂肪芽孢杆菌中发现质粒pGS18，且该属质粒具有作为基因工程工具的潜力。但该属质粒信息目前报道较少，目前只有3种已经测序完全的质粒(pSTK1、pHTA426、pLW1071)。本试验发现Commercial isolate携带大小为45 kb的质粒，并对质粒功能区域进行标注，以丰富嗜热芽孢杆菌的基因组数据信息。与之前的研究一致，该属质粒除转移原件外，79%的开放阅读框编码的蛋白功能不清，探究其编码的蛋白功能可更好地将该属质粒用于基因工程。

本试验将2株嗜热脂肪芽孢杆菌菌株进行全基因组的三代测序，基于核心基因组数据分析了解菌株特性。在此基础上探究了嗜热脂肪芽孢杆菌的质粒构成元件，丰富了此菌株的质粒基因组数据库，为其作为工程性质粒奠定了基础。药物敏感性测定为2株分离菌株作为微生物抑制剂候选菌株提供数据支持。综上，本试验为嗜热芽孢杆菌的应用及基因组数据库的扩充提供前期理论依据。