鸡源沙门菌的分离鉴定、血清分型和耐药性分析

姬书会，郭世栋，苏玉贤

(1.平顶山市农业综合行政执法支队，河南 平顶山 467000 ； 2.新乡市动物疫病预防控制中心 ，河南 新乡 453000 ； 3.平顶山市畜牧技术推广站，河南 平顶山 467000)

沙门菌(Salmonella)是肠杆菌科的重要致病菌属，在人和动物的肠道细胞内寄生，可引起动物腹泻、人肠胃炎和食物中毒。沙门菌血清型繁多，国内报道的有290多种[1]。绝大部分血清型对人类和畜禽有致病性，是一种重要的人兽共患病病原菌和食源性致病菌[2]。

鸡源沙门菌病是某些致病性沙门菌引起的鸡白痢病、鸡副伤寒病和鸡伤寒病的统称，通常造成雏鸡腹泻、脱水，甚至死亡，成年鸡呈慢性或隐性感染，长期携带病原菌，蛋鸡产蛋性能下降。病鸡和带菌鸡为主要传染源，可以水平和垂直传播，养鸡场如果发生疫情很难完全净化，严重危害养鸡业健康发展，同时也直接威胁公共卫生安全。

目前，养鸡场在加强生物安全、疫苗免疫防控的同时，使用抗生素成为预防和治疗该病的临床用药主要手段。但是，由于抗生素的长期大量使用和不合理用药，导致沙门菌株耐药性越来越强，尤其是多重耐药现象不断出现，动物成为耐药菌的重要储存库[3]，给有效防治沙门菌病带来很大困难。由于沙门菌血清型众多，不同地区或者同一地区内的流行菌株也存在差异[4]，因此，了解当地鸡源沙门菌流行特点和耐药性情况，对于有效防控鸡沙门菌病具有重要指导意义。本试验于2020年采集河南省平顶山和新乡地区鸡源病料进行细菌分离鉴定、血清型分析和耐药性检测，为今后鸡源沙门菌病净化、筛选临床安全合理用药提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源和菌株 无菌采集河南省平顶山、新乡35个规模化蛋鸡、肉鸡场的疑似患沙门菌病的鸡的鸡蛋、肝脏、脾脏、肛拭子和肠道等器官组织样品154份。大肠埃希菌(ATCC29922)和肠炎沙门菌标准株(CVCC3377)，均购自中国兽医药品监察所。

1.2 主要试剂 缓冲蛋白胨水(BPW)、四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液、亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液、SS琼脂培养基、沙门菌属显色培养基、LB液体培养基，均购自青岛海博生物技术有限公司；细菌微量生化反应管、沙门菌属血清诊断试剂盒(60种)，均购自兰州生物制品有限公司；DL2 000 DNA Marker、2×PCR Premix、细菌基因组DNA提取试剂盒，均购自宁波天润生物药业有限公司；15种K-B药敏纸片，包括大观霉素(SPT)、氨苄西林(AMP)、环丙沙星(CIP)、呋喃唑酮(FUR)、阿米卡星(AN)、氟苯尼考(FLO)、链霉素(STR)、复方新诺明(SXT)、新霉素(NTL)、阿奇霉素(AZM)、多西环素(DOX)、左氧氟沙星(LEV)、庆大霉素(CN)、头孢曲松(CTRX)、头孢喹肟(CTX)，均购自杭州天河微生物试剂有限公司。

1.3 细菌分离培养 参照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》(GB 4789.4—2016)进行沙门菌的分离培养。每份称取25 g样品放入含225 mL BPW的无菌均质袋，10 000 r/min离心1～2 min,(36±1)℃培养8～18 h。取上述样品混合物1 mL接种于10 mL TTB增菌液，(42±1)℃培养18～24 h，同时，另取上述样品混合物1 mL接种于10 mL SC增菌液，(36±1)℃培养18～24 h。然后，用接种环挑取增菌液分别接种于沙门菌属显色培养基和SS琼脂平板，(36±1)℃下培养18～24 h。观察每个平板上的菌落特征。挑取沙门菌属显色培养基上紫色菌落和SS平板上的无色透明或黄色、有黑点的菌落进行纯培养和细菌涂片，革兰染色镜检，观察菌体形态。

1.4 生化鉴定 用生理盐水将疑似菌落制备成滴度适当的菌悬液，无菌接种于靛基质(Indole)、pH 7.2尿素(URE)、硫化氢(H2S)、氰化钾(KCN)、蔗糖(SAC)、葡萄糖(GLU)、甘露醇(MAN)、山梨醇(AG)、赖氨酸(Lys)和V-P试验细菌微量生化反应管，37 ℃恒温箱中培养24～48 h，观察记录结果。结果判定依据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》(GB 4789.4—2016)进行。

1.5 PCR鉴定 挑取待检菌落接种于10 mL LB液体培养基，37 ℃振摇培养6 h，备检待用。使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取疑似沙门菌和对照菌株基因组DNA，并设大肠埃希菌(ATCC29922)为阴性对照和肠炎沙门菌标准株(CVCC3377)为阳性对照。根据GenBank(登录号：JQ665438.1)发表的序列，针对沙门菌fimY基因设计1对引物，上游引物序列：5′-CGCCCAGCCATACGGATAACC-3′,下游引物序列：5′-TACCACGCAGGAAAGACACC-3′。引物由中美泰和生物技术(北京)有限公司合成，预期扩增片段大小427 bp。PCR反应体系(25 μL)：2×PCR Premix 12.5 μL，DNA模板0.5 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O补至25 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。取5 μL扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，使用凝胶成像仪观察结果并记录。

1.6 血清型鉴定 分离菌株的血清型分群和定型鉴定根据GB 4789.4—2016标准采用玻片凝集试验方法。待检菌以1.2% LB琼脂作为测定A～F、O、H抗原的培养基，37 ℃培养12 h，用生理盐水制备成2麦氏单位的菌悬液。取20 μL血清诊断试剂盒中的血清于洁净玻片上，再挑取20 μL菌悬液与血清摇动混匀30 s，观察凝集结果。同时，设生理盐水为阴性对照试验，观察菌株是否发生自凝现象。1 min 内凝集者判为阳性，均匀浑浊或清亮者为阴性。根据菌体O抗原和鞭毛H抗原鉴定结果，查阅沙门菌抗原表，进行被检菌株血清型分群和定型。

1.7 药敏试验 药敏质控菌株为肠炎沙门菌标准株CVCC3377。采用世界卫生组织(WHO)提供的药敏纸片琼脂扩散法(Kirby-Baue)测定48株分离菌对15种常见抗菌药的耐药性，测量抑菌圈直径大小，依据美国临床和实验室标准协会(CLSI)标准判定15种抗菌药的敏感(S)、中介(I)和耐药(R)结果，根据药敏试验判定耐药表型。

2 结果

2.1 细菌分离培养 (36±1)℃下培养18～24 h后，沙门菌属显色培养基的菌落呈现为大小一致、边缘整齐的紫色菌落，SS琼脂平板上菌落呈现圆形、黑色金属光泽，有些为中间黑色菌落，周围培养基没有变化。革兰染色为阴性，镜检可见短杆状菌，两端钝圆，单个、成对或成丛存在。共有48株初步判定为疑似沙门菌菌株。

2.2 生化鉴定 生化试验鉴定结果显示，48株分离菌株均能分解甘露醇、葡萄糖和山梨醇，不发酵蔗糖，赖氨酸、硫化氢试验阳性，靛基质、尿素、V-P试验阴性，依据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》(GB 4789.4—2016)符合典型的沙门菌特征。

2.3 PCR鉴定 部分分离菌株PCR鉴定结果见图1。凝胶电泳结果显示，以沙门菌fimY基因引物对48株分离菌株进行PCR扩增鉴定，均能扩增出大小约为427 bp的目的片段，与预期片段大小一致，阴性对照无条带。对来自平顶山、新乡不同县市的样品和鉴定结果统计，48株沙门菌中平顶山有29株(郏县13株、叶县9株、舞钢7株)，新乡有19株(延津11株、原阳8株)。结合生化鉴定结果，本次沙门菌检出率为31.17%，表明平顶山和新乡均有不同程度鸡源沙门菌感染。

图1 部分沙门菌分离菌株的PCR鉴定

2.4 血清型鉴定 采用玻片凝集法对48株沙门菌进行血清型分型试验，结果显示，共鉴定出44株沙门菌的血清型，占沙门菌分离株的91.67%(44/48)，分属3个大群5种血清型，包括19株鸡白痢沙门菌(39.58%)、13株肠炎沙门菌(27.08%)、7株鼠伤寒沙门菌(14.58%)、3株甲型副伤寒沙门菌(6.25%)和2株乙型副伤寒沙门菌(4.17%)，其余4株未确定出血清型。优势血清型为鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌。平顶山和新乡地区血清型分布见表1。

表1 平顶山和新乡地区鸡源沙门菌血清型分布

2.5 药敏试验 对48株鸡源沙门菌进行15种抗菌药耐药性检测，结果见表2、表3。分离菌株对氨苄西林耐药率最高，为95.83%，其次，对呋喃唑酮(66.67%)、大观霉素(64.58%)、链霉素(62.50%)也具有较高的耐药性；对氟苯尼考(22.92%)、环丙沙星(12.50%)、复方新诺明(12.50%)、左氧氟沙星(10.42%)耐药率相对较低；对头孢喹肟(8.33%)、头孢曲松(8.33%)、庆大霉素(6.25%)、阿米卡星(6.25%)、多西环素(4.17%)、阿奇霉素(4.17%)和新霉素(2.08%)比较敏感，耐药率均低于10.00%。

表2 分离菌株药敏试验

表3 48株沙门菌分离株血清型抗菌药耐药谱

在48株鸡源沙门菌分离株中，有 2 株(4.17%)不耐药，对所有试验药物均表现敏感，9株对2种抗菌药耐药，其余37 株则表现出多重耐药现象(耐 3 种及 3 种以上抗菌药)，多重耐药率为77.08%。耐药模式较多，以4重耐药最多，有15 株，占31.25%(15/48)；最多耐受8种抗菌药物，有1株，占2.08%(1/48)。

3 讨论

本试验采用传统细菌分离鉴定和PCR方法对来自平顶山、新乡的154份鸡源样品进行分离鉴定，共分离鉴定出鸡源沙门菌48株，检出率为31.17%，明显高于钱明珠等[5]对河南省部分鸡沙门菌流行病调查报道的分离率(27.97%)和杨瑞等[1]在2019—2020 年对河北地区鸡源沙门菌流行病学调查报道的分离率(25.51%)。本次调查结果表明，被调查养鸡场鸡源沙门菌分布较广，污染较重，建议引起重视，加强疫病防控，减少污染面。

本试验血清学分型结果显示，共鉴定出5种血清型，其优势血清型为鸡白痢沙门菌(39.58%)和肠炎沙门菌(27.08%)。多地学者研究结果显示[6-8]，这2种血清型感染宿主范围广，是我国养鸡场常见的流行菌株。作为肠杆菌科沙门菌属成员的鸡白痢沙门菌是严重危害养鸡业的常见致病菌，可以引起鸡败血症、鸡白痢病。肠炎沙门菌是造成动物感染沙门菌和引起人类食物细菌性中毒的重要病原菌之一。此外，本试验还检出鼠伤寒沙门菌(14.58%)、甲型副伤寒沙门菌(6.25%)和乙型副伤寒沙门菌(4.17%)。表明上述血清型不同程度存在于两地区鸡群和饲养环境中，因此，需要以本地流行血清型为重点加强监测。

本试验对48株分离菌进行了15种抗菌药耐药性检测，结果显示，分离菌对氨苄西林、呋喃唑酮、大观霉素和链霉素具有较高的耐药性，耐药率高于60.00%，与宋艳等[9]报道基本一致，这与当地养鸡场长期不规范使用抗菌药有关，导致鸡沙门菌耐药性增强；尽管分离菌对头孢喹肟、头孢曲松、庆大霉素、阿米卡星、多西环素、阿奇霉素和新霉素比较敏感，但是部分抗菌药的中敏率偏高，比如新霉素、头孢喹肟、头孢曲松的中敏率分别为60.42%、43.75%和41.67%，说明这些药物在临床一线用药中也存在不合理使用现象，应引起关注和跟踪监测。本试验中48株鸡源沙门菌多重耐药率为77.08%，多重耐药谱较广，以4重耐药最多，最多耐受8种抗菌药物，耐药谱型较多。

本试验结果表明，平顶山和新乡地区鸡源沙门菌耐药性比较严重，耐药表型多样化，提示在养殖环节临床治疗和预防过程中应科学合理使用抗菌药，强化流行病学调查和耐药性监测，联合用药，轮换用药，使用抗菌药替代品，避免耐药性进一步严重。