人MAPK3基因克隆及其在肝细胞癌细胞中的作用

倪 佳，徐莹莹，邓婉玲，宋苗苗，石 静，孙达权

(1.贵阳市妇幼保健院·贵阳市儿童医院，贵州 贵阳 550001；2.宁波市第一医院 疝肝胆肛肠外科，浙江 宁波 315000；3.贵州医科大学 基础医学院，贵州 贵阳 550025)

丝裂原活化蛋白激酶3(Mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3)是由MAPK3 基因编码的一种分子量44 kDa的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，又名细胞外信号调节激酶1(Extracellular signal-regulatedkinase 1，ERK1)，是MAPK家族的重要成员之一，它通常与分子量42 kDa的丝裂原活化蛋白激酶1(Mitogen- activated protein kinase 1，MAPK1)共同组成MAPK1/3，是Ras(Rat sarcoma proto-oncoprotein)-MAPK信号通路的重要成员[1-3]。大量研究表明，MAPK1/3不仅参与细胞的多种生理功能，如细胞的生长增殖、迁移、分化、稳态调节和凋亡等，也与多种细胞病变有关，许多癌基因编码的蛋白可通过持续激活MAPK1/3，诱发肿瘤的发生发展和肿瘤血管生成等[4-7]。到目前为止，虽然有许多文献描述了MAPK1/3的生物学功能，但单独研究MAPK3对肝细胞癌影响作用的文献较少。本研究通过克隆人MAPK3基因和构建MAPK3基因稳转克隆肝细胞癌细胞株，研究MAPK3基因对肝细胞癌细胞生长增殖、迁移和侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞 人永生化肝上皮细胞THLE-3(C4144)和人肝细胞癌细胞Hep 3B(SCSP-5045)分别购自上海冠导生物工程有限公司和中科院上海细胞库，均有STR鉴定结果。THLE-3细胞用含有10 %胎牛血清的RPMI-1640培养，Hep 3B细胞用含有10 %胎牛血清的MEM(minimum Eagle’s medium)培养，培养条件为37 ℃、5 % CO2。

1.2 主要试剂 PrimeScriptTMIV 1st strand cDNA Synthesis Mix(6215A)、PrimeSTAR®Max DNA Polymerase(R045A)、TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(9762)、DL10,000 DNA Marker(3584A)、pMDTM18-T Vector Cloning Kit(6011)、EcoR I(1040A)、XhoI(1094A)、T4 DNA Ligase(2011A)(TaKaRa，日本)，质粒小提试剂盒(DP103)、DH5a 感受态细胞(CB101)、无内毒素质粒小提中量试剂盒(DP118)(天根生物，中国)，MEM(含GlutaMAXTM添加剂，41090036)、RPMI 1640 培养基(31870082)、PierceTMBCA 蛋白定量试剂盒(23225)、TRIzolTM试剂(15596026)、LipofectamineTM2000 Transfection Reagent(11668019)、GeneticinTM选择性抗生素(11811023)(ThermoFisher Scientific，美国)，优级胎牛血清(11011-8611)(天杭生物，中国)，PCR引物和DNA测序(博迈德，中国)，真核表达载体pEYFP-N1长期保存于本实验室，可用于检测YFP的GFP-tag (3A10) monoclonal antibody(AP0675M)、ERK1/2 (L352) polyclonal antibody(BS1112)、GAPDH polyclonal antibody(AP0063)、Stat3 (S727) polyclonal antibody(AP0366)、Stat3 (phospho-S727) polyclonal antibody(BS4180)、MMP-2 (L638) polyclonal antibody(BS1236)、HRP标记的二抗(BS13278、BS12478)(巴傲得，中国)，E-Cadherin(WL01482)、N-Cadherin(WL01047)、Vementin(WL01960)、c-Myc(WL01781)(万类生物，中国)，基底胶Matrigel(356234)(索莱宝，中国)。

1.3 方法

1.3.1 基因克隆与测序 根据NCBI中人MAPK3的基因序列(NM_002746)和真核表达载体pEYFP-N1的多克隆位点设计并合成一对聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)引物(见表1)，在上游引物的5′端引入XhoI酶切位点，下游引物的5′端加入EcoR I酶切位点，小写部分为XhoI酶切位点，最前端的两个碱基为保护性碱基；小写部分为EcoR I酶切位点，最前端的两个碱基为保护性碱基。

表1 人MAPK3的PCR引物

用6 cm小皿培养人肝上皮细胞THLE-3，当细胞生长融合至80%时，弃去培养基，用磷酸盐缓冲液清洗细胞3次后，加入1 mL TRIzol试剂，充分吹打和裂解细胞，按说明书程序提取细胞总RNA，并将RNA溶液定容至1 μg/μL。按cDNA反转录试剂盒说明书流程合成cDNA第一链。以合成的cDNA模板，用人MAPK3 PCR引物根据高保真DNA聚合酶说明书操作流程体外扩增获得人MAPK3基因蛋白编码区。

用1%琼脂糖凝胶电泳分离和纯化PCR扩增获得的人MAPK3基因蛋白编码区，通过3′末端加“A”试剂盒给纯化的PCR产物加“A”，然后克隆入pMD18-T载体中。经转化、筛选培养和酶切鉴定后，对可能含有MAPK3基因的重组载体进行DNA测序，测序结果用BioXM 2.6进行比对，测序正确的质粒命名为pMD18T-MAPK3。

1.3.2 构建重组真核表达质粒 用XhoI/EcoR I双酶切真核表达载体pEYFP-N1和含有目的基因的pMD18T-MAPK3，用1%琼脂糖凝胶分离和纯化骨架载体和目的基因，并用T4连接酶将两者连接起来。经转化、抗生素筛选培养、质粒抽提和双酶切鉴定后，对可能重组正确的质粒进行DNA测序，测序正确的重组真核表达载体命名为pEYFP-MAPK3。

1.3.3 构建稳转克隆肝细胞癌细胞株 用无内毒素质粒小提中量试剂盒提取质粒pEYFP-MAPK3，并将DNA浓度定容为1 μg/μL。 在6孔板中按最大细胞数的50%铺板人肝细胞癌细胞Hep 3B，细胞贴壁后更换为无血清的MEM细胞培养液，按LipofectamineTM2000 Transfection Reagent说明书对细胞稳定转染pEYFP-MAPK3，转染后6 h更换为含10%胎牛血清的MEM培养液继续培养，转染后48h在倒置荧光显微镜下观察细胞荧光。将转染的细胞消化并传至10 cm细胞培养皿中继续培养，转移后72 h后在培养液中加入600 μg/mL的G418，筛选培养5d后更换为含300 μg/mL Geneticin的细胞培养液。待细胞长成单克隆后，在倒置荧光显微镜下挑取带黄色荧光的单克隆细胞株，转移到96孔板中继续培养，经扩大培养后进行验证和后续实验。该实验方法是根据文献[8]和具体实验改编而成。

1.3.4 蛋白免疫印迹实验 细胞生长融合至70%时，胰酶消化并收集细胞，抽提细胞蛋白并用BCA 蛋白定量试剂盒对蛋白溶液进行定量，制备蛋白样品后进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)。电泳结束后对蛋白进行湿法转膜，用TBST清洗对PVDF膜3次，用5%脱脂奶粉在37℃封闭30 min，TBST清洗3次，一抗4℃孵育过夜，TBST清洗3次，二抗室温孵育2 h，TBST清洗3次，ECL发光成像。用Image J获取目的条带的灰度值。

1.3.5 细胞生长增殖实验 取1 000个细胞铺于E-Plate L16中，每孔用含10%胎牛血清的MEM定容至终体积200 μL，室温下放置30 min，将E-Plate L16放到iCelligence分析仪上进行实时检测。在系统自动扫描“Scan Plate”后，开始绘制出相应的细胞增殖曲线。细胞指数值与细胞数量成正相关，即细胞指数越大，孔内细胞数目越多，细胞增殖能力越强。

1.3.6 划痕愈合实验 将细胞按100%的融合率接种于12孔板中，每组设置3个复孔。待细胞贴壁后用10 μL的枪头紧贴着消毒过的直尺在孔中间按“|”轻轻划痕，PBS洗去漂浮的细胞，加入1 mL新鲜的不含血清的MEM培养液培养，并在0、48 h时分别在显微镜下记录细胞的愈合情况。

1.3.7 细胞侵袭实验 将基底胶用MEM细胞培养液按1∶10稀释(冰浴操作)，取稀释后的基底胶100 μL加入到Transwell小室中，细胞培养箱中放置5 h，倒掉小室中的液体，用磷酸盐缓冲液清洗1次。将消化并用磷酸盐缓冲液清洗后的细胞用无血清的MEM细胞培养液稀释混匀，按100%的融合率接种至Transwell小室中，并用MEM定容至200 μL；在24孔板的孔中加入600 μL含10%胎牛血清的MEM细胞培养液，将铺了细胞的Transwell小室移入24孔板中，培养24 h后取出Transwell小室，4%多聚甲醛室温固定30 min后用结晶紫染色，自来水清洗脱色，用棉签拭去小室内侧的细胞。每孔随机选取3个视野拍照记录，每组设置3个复孔。

1.4 统计学分析 用软件SPSS 21.0对实验数据进行分析。两组组间分析采用独立样本t检验分析，P< 0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 获得人MAPK3基因蛋白编码区和重组真核表达质粒pEYFP-MAPK3 如图1A所示，以人肝上皮细胞cDNAs为模板，通过RT-PCR获得长度约1.1 kb的人MAPK3基因的蛋白编码区。TA克隆后，DNA测序结果显示RT-PCR产物正是人MAPK3基因的蛋白编码区，且无任何形式的突变。将人MAPK3基因蛋白编码区通过XhoI/EcoR I酶切位点插入到真核表达载体pEYFP-N1中，构建pEYFP-MAPK3(见图1B)，DNA测序结果显示MAPK3准确插入到pEYFP-N1的预定碱基中，其质粒图谱如图1C所示。

A：RT-PCR扩增人MAPK3基因蛋白编码；B：Xho I/ EcoR I双酶切鉴定重组真核表达质粒pEYFP-MAPK3；C：质粒pEYFP-MAPK3图谱。

2.2 建立MAPK3基因稳转克隆肝癌细胞株 用脂质体法将重组质粒pEYFP-MAPK3导入肝细胞癌细胞Hep 3B后，经药物筛选培养和克隆集落扩大培养，选取荧光显微镜下呈黄色荧光的细胞集落(见图2A)，分别用可以检测YFP蛋白的GFP标签抗体和检测MAPK3蛋白的MAPK3/2抗体对细胞内表达的目的蛋白进行验证，结果如图2B所示，筛选获得的单克隆肝细胞癌细胞株内过表达带有YFP的MAPK3融合蛋白MAPK3-YFP，证明MAPK3基因稳转克隆肝细胞癌细胞株构建成功。

A：外源MAPK3基因融合蛋白(MAPK3-YFP)在荧光显微镜下使肝细胞癌细胞Hep 3B呈黄色；B：外源MAPK3-YFP在肝细胞癌细胞Hep 3B(Ov-MAPK3)中表达。

2.3MAPK3基因促进肝细胞癌细胞生长增殖、迁移和侵袭 为分析MAPK3基因对肝细胞癌细胞表型的影响，本组以表达外源YFP蛋白的Hep 3B为对照细胞，通过实时无标记细胞分析技术发现表达MAPK3融合蛋白的肝细胞癌细胞的生长和增殖速率明显提高(P=0.017，见图3A)；同时，细胞损伤-愈合实验结果显示MAPK3能够显著提高癌细胞的迁移能力(P=0.022，见图3B)；另外，细胞侵袭实验结果显示肝癌细胞表达外源MAPK3后，侵袭的癌细胞数增加(见图3C)。以上结果显示，在肝细胞癌细胞中过表达外源MAPK3基因后，可以促进癌细胞的生长和增殖速度、迁移能力和侵袭能力。

A：MAPK3基因促进肝癌细胞Hep 3B生长增殖；B：MAPK3基因促进肝癌细胞Hep 3B迁移；C：MAPK3基因促进肝癌细胞Hep 3B侵袭；*：与对照组比较， P<0.05。

2.4MAPK3基因影响肝癌细胞内相关的基因表达 为分析MAPK3基因是如何影响肝细胞癌细胞表型的，本组先对MAPK3下游分子信号传导子及转录激活子(Signal transducer and activator of transcription，Stat3)进行分析，发现过表达MAPK3在不影响Stat3蛋白整体水平，但可以显著提高p-Stats727的表达水平(P=0.046)，并促进Stat3的靶基因蛋白c-Myc(P=0.031)和基质金属蛋白酶-2(Matrix metalloproteinase-2，MMP-2)(P=0.043)的表达水平(见图4)。此外，过表达的MAPK3还可以明显促进肝细胞癌细胞中N-Cadherin的表达(P=0.025)并抑制E-Cadherin(P=0.017)的表达，但Vimentin的表达基本不受MAPK3过表达的受影响(见图4)。这些蛋白表达变化可能就是引起肝细胞癌细胞表型变化的分子基础。

*：与对照组比较， P<0.05。

3 讨论

肝细胞癌具有复杂的肿瘤分子发病途径，MAPK途径是其重要的途径之一[9]。MAPKs是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者，MAPK1/3是ERK家族的重要成员，主要通过修饰转录因子而影响靶基因的转录与表达，参与细胞代谢和生理活动[10-11]。研究表明，MAPK1/3异常表达及其信号通路活化与多种肿瘤发生发展有密切的关系[1,3,7,9,11]。但是，MAPK1/3并非是一个蛋白，也不是同一个基因的表达产物；实际上它们是一对由高度同源的基因，即MAPK1基因和MAPK3基因，各自编码的不同蛋白质，两者在蛋白质的一级结构上具有85%的相似性。由于这两个蛋白的分子量相近且的免疫原相似，且具有诸多类似的生物学功能而被书写成MAPK1/3。事实上，两种蛋白质的一级结构上还是存在些许差异的。首先，MAPK3蛋白在N-末端比MAPK1多出一段氨基酸残基序列：GGEPRRTEGVGPGVPGE，这可能可以赋予MAPK3新的蛋白特性和对应的生物学功能。研究发现，由于MAPK3 N-末端的这段特殊序列存在，导致其在胞质中磷酸化活化后的入核速度显著低于MAPK1，使细胞核内MAPK3总体磷酸化水平降低，最终导致MAPK3的促细胞增殖能力显著降低[12-13]。但MAPK3仍具有调节细胞生长增殖的能力，如在大鼠PC12细胞中，用microRNA-15b-5p结合MAPK3 3′UTR RNA，抑制ERK1表达后可减缓细胞的生长增殖速度[14]。还有研究发现，MAPK3可以促进白血病细胞HL-60的生长增殖速率，这一促进作用可以被与MAPK3 3′UTR RNA 结合的miR-143所阻断[15]。此外，MAPK3还在其他多个方面展现其独特的生物学作用，包括特异性调控脂肪细胞分化[16]、诱发实验性哮喘[17]、诱导破骨细胞形成[18]、抑制视网膜损伤[19]、自身免疫性脑脊髓炎[20-21]以及诱导肝纤维化进程[22]等。这些研究均表明，除与MAPK1相似的生物学功能外，MAPK3还具有不同于MAPK1的特殊生物学功能。因此，有必要单独展开MAPK3和MAPK1的生物学功能研究以及两者之间的关联性和差异性。

为分析MAPK3在肝细胞癌细胞中的作用，本研究首先以人肝上皮细胞来源的mRNA为模板，利用RT-PCR反转录扩增获得人MAPK3基因的蛋白编码区，并构建了真核表达载体pEYFP-MAPK3；通过脂质体转染、geneticin药物筛选、克隆选取培养与蛋白免疫印迹鉴定，成功获得过表达MAPK3基因的肝细胞癌细胞克隆株。然后，利用实时无标记细胞分析技术、细胞损伤-愈合实验和细胞侵袭实验分别证明过表达ERK1基因可以加速肝细胞癌细胞的生长增殖速率、提高肝细胞癌细胞的迁移能力和侵袭能力。有趣的是在另一个研究中，我们发现当用RNAi单独敲低肝细胞癌细胞内源性MAPK3后，细胞的生长增殖能力并未受到显著影响(数据未列出)，这可能与肝细胞中MAPK1的表达量显著多于MAPK3有关，并且在四肢类生物中MAPK3基因和MAPK1基因呈现功能冗余[23]。由此我们认为，要完全了解MAPK3在肝细胞癌细胞中的作用，不仅要结合MAPK3基因敲除的结果，还要与MAPK1基因过表达与敲除的肝细胞癌细胞表型相结合，才有可能能得出全面并精准的实验结论，准确掌握MAPK3在肝细胞癌细胞中的生物学功能。

此外，我们还对过表达MAPK3后导致肝细胞癌细胞表型恶化的分子基础进行了初步探索，发现肝细胞癌细胞过表达MAPK3后，细胞内MAPK3的下游靶蛋白Stat3的磷酸化水平上升。Stat3是一种功能复杂的核转录因子和癌蛋白，广泛高表达和超活化于多种癌细胞和肿瘤生态系统中的非癌细胞中，研究指出人类有超过50%的肿瘤组织中Stat3高度表达并具有成百上千个转录靶基因[24-25]。我们对其中两个具有促进细胞生长作用的c-Myc和可引起细胞外基质降解的MMP-2的靶基因蛋白进行分析验证，发现细胞内的c-Myc和MMP-2表达同时升高。另外，研究还发现过表达MAPK3可以促进N-Cadherin并抑制E-Cadherin的表达。这些基因的表达变化可能与MAPK3诱导肝细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭有关。但是，我们相信MAPK3增强肝细胞癌细胞的癌性不仅仅与上述基因的表达变化有关，应该还有更多基因受MAPK3的表达而受到影响，而这些基因需要进一步去探索和挖掘。