金刚丸调节Hippo信号通路mRNA表达防治OVX大鼠骨质疏松作用机制

王剑 李屹 王实 刘永林 刘秀 丰雪妮 马越娇 郭婧潭 刘剑辉 刘文艳 张景云 马金 宋光熠 郑洪新

1. 辽宁医药职业学院，辽宁 沈阳 110101

2. 辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMOP)为原发性Ⅰ型骨质疏松症，由于妇女绝经后雌激素缺乏诱导骨质流失、骨组织微结构损坏、骨变脆、骨折风险增加[1]。随着我国步入老龄化社会，其危害日益严重[2]。PMOP属中医“骨痿”范畴，主要由于绝经后妇女肾精不足、生髓乏源、骨失滋养所致[2]。金刚丸(金·刘完素《素问病机气宜保命集》)的功能为填精补肾、强筋壮骨，主肾损骨痿，可提高骨矿含量和雌激素水平，有效治疗PMOP[3-4]，但关于其作用机制的研究颇少。近年来，细胞生命活动的重要调节器-Hippo信号通路调节骨代谢的机制研究成为热点[5-6]，通路核心基因Mst2缺乏的小鼠表现出骨质疏松症表型[7]，核心分子TAZ是成骨细胞分化的重要分子标志[8]，二者有望成为防治骨质疏松症新的有效靶点。因此，本研究基于Hippo信号通路核心基因mRNA表达，探索金刚丸防治PMOP的作用机制，为PMOP的中医药防治提供科学的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：SPF级Wistar雌性大鼠108只，3月龄，体重(220±20)g，购于辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号：SCXK(辽)2020-0001，饲养于环境室温20 ℃～25 ℃、湿度40 %～60 %，自由饮水、进食(大、小鼠维持饲料，购于辽宁长生生物技术股份有限公司)。

1.1.2实验药品：金刚丸(成份：肉苁蓉、猪腰子、绵萆薢、菟丝子、炒杜仲，“益铭博大”陕西天洋制药有限责任公司，国药准字Z61020726)；仙灵骨葆胶囊(成份：淫羊藿、续断、丹参、知母、补骨脂、地黄，国药集团同济堂[贵州]制药有限公司，国药准字Z20025337)；骨化三醇胶丸((5Z,7E)-9,10-开环胆甾-5,7,10(19)-三烯-1α,3β,25-三醇，“罗盖全”Roche Pharma(Schweiz)AG，进口药品注册证号：H20140598;H20140597，上海罗氏制药有限公司分装，国药准字J20150011)。

1.1.3主要仪器：STRATOS DR X射线骨密度测定仪(Diagnostic Medical System SA，法国)、石蜡切片机(莱卡，德国)、BX51显微镜(OLYMPUS，日本)、ELx800酶标仪(Biotek，美国)、Stratagene Mx3000P荧光定量PCR仪(安捷伦，德国)、BioDrop Duo核酸蛋白分析仪(BioDrop，英国)。

1.1.4主要试剂：苏木素染色液(武汉博士德生物工程有限公司，货号：AR1180-1)、伊红染色液(武汉博士德生物工程有限公司，货号：AR1180-2)、大鼠碱性磷酸酶(ALP)酶联免疫检测试剂盒(AMEKO，货号：AE91640Ra)、总RNA提取试剂盒(柱式法，Takara，货号：9767)、反转录试剂盒(Takara，货号：RR047A)、定量PCR试剂盒(嵌合荧光法，Takara，货号：RR820A)。

1.2 方法

1.2.1分组与造模：适应性喂养大鼠3 d后，完全随机分出正常组与假手术组,各12只，余者造模。除正常组外，均采取腹腔注射戊巴比妥钠方式麻醉(2 %，35 mg/kg)。将大鼠麻醉后，除假手术组外，均采取腹部切口摘除双侧卵巢建立PMOP大鼠模型[9]，假手术组只行腹部切口而不摘除卵巢，局部涂适量青霉素预防感染。术后，造模大鼠死亡1只，存活83只。完全随机分为模型组13只，金刚丸高、中、低剂量组、仙灵骨葆对照组、骨化三醇对照组各14只。

1.2.2给药：术后7 d开始灌胃给药，1次/d(每灌6 d间歇1 d)，连续12周。给药剂量：大鼠等效剂量为成人(成人体质量按60 kg，成人每日用药剂量依据临床用药的药品说明书)的6.3倍。金刚丸高剂量组(大鼠等效剂量的2倍)：3.78 g/kg体质量；金刚丸中剂量组(大鼠等效剂量)：1.89 g/kg体质量；金刚丸低剂量组(大鼠等效剂量的1/2)：0.945 g/kg体质量；仙灵骨葆对照组(大鼠等效剂量)：0.315 g/kg体质量；骨化三醇对照组(大鼠等效剂量)：0.052 5 μg/kg体质量。给药容积：金刚丸高剂量组：1.5 mL/100 g体质量；其余各组：1 mL/100 g体质量。正常组、假手术组、模型组：给予等体积生理盐水。灌胃药液制备：金刚丸为小粒水蜜丸，以蒸馏水冷藏泡软后，在研钵内研碎，制成混悬药液；仙灵骨葆以蒸馏水分散胶囊内药粉，制成混悬药液；骨化三醇以蒸馏水冷藏泡软胶丸后，剪破囊壁，其内油状液流出，加少量淀粉，灌胃器反复抽推吸打，助其分散于蒸馏水中。

1.2.3取材：末次灌胃后，禁食24 h，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉(2 %，35 mg/kg)，颈动脉取血，3 000 r/min离心15 min，取血清，待测ALP；每组左后肢前10号取股骨头，先经液氮速冻，再放置-80 ℃冰箱冻存，待做实时定量RT-PCR；余者取全股骨，用10 %甲醛溶液固定，待做石蜡切片；每组右后肢全部取全股骨(骨化三醇对照组2只股骨未取完整，不用于指标检测)，置于-20 ℃冰箱冻存，待测骨密度。

1.2.4指标检测

1.2.4.1骨密度：用X射线骨密度测定仪检测离体股骨骨密度，精细模式扫描，用仪器附带的小动物软件(版本：V4.0.7.1)分析，结果示值为单位面积骨矿含量(g/cm2)。

1.2.4.2骨显微形态结构：通过10 %硝酸脱钙法制作股骨头石蜡切片，HE染色，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察(200倍)并拍照。

1.2.4.3血清ALP：采用ELISA法按照试剂盒说明书进行血清ALP检测。准备试剂、样品和标准品，加样，洗板，显色，终止，以空白孔调零，于450 nm波长处读各孔OD值，计算样品ALP浓度。

1.2.4.4骨组织Mst2、Lats1、Taz mRNA表达：按照总RNA提取(柱式法)和反转录试剂盒说明书进行总RNA提取(使用核酸蛋白分析仪检测RNA浓度，分光光度法测波长260 nm与280 nm的OD值，计算OD260/OD280，约在2.0左右，提示为RNA纯品。)和反转录，使用荧光定量PCR仪，按照定量PCR试剂盒(嵌合荧光法)说明书进行QPCR。使用Primer-BLAST设计引物，引物序列见表1。以β-actin进行校准，以各样品Ct值计算样品各目标基因的mRNA相对表达量。

表1 引物序列

1.3 统计分析

2 结果

2.1 离体股骨骨密度

与正常组比较，模型组离体股骨骨密度显著降低(P<0.01)；与模型组比较，除金刚丸低剂量组[离体股骨骨密度有升高趋势，但无统计学意义(P>0.05)]外，各给药组离体股骨骨密度均显著升高(P<0.01)。见表2。

表2 各组大鼠离体股骨骨密度

2.2 股骨头显微形态结构

与正常组比较，模型组股骨头密质骨板变薄、多孔、孔大，松质骨小梁变细、断裂、破坏，骨髓腔显著扩大，骨微结构显著破坏；与模型组比较，各给药组以上骨微结构病变、破坏均得以改善，以金刚丸高、中剂量组改善最显著。见图1。

图1 各组大鼠股骨头显微形态结构(200倍)

2.3 血清ALP

与正常组比较，模型组血清ALP显著降低(P<0.01)；与模型组比较，各给药组血清ALP均显著升高(P<0.01)。见表3。

表3 各组大鼠血清

2.4 骨组织Mst2、Lats1、Taz mRNA表达

与正常组比较，模型组骨组织Mst2、Lats1 mRNA表达显著升高(P<0.01)，Taz mRNA表达显著降低(P<0.01)；与模型组比较，各给药组骨组织Mst2、Lats1 mRNA表达均显著降低(P<0.01)，Taz mRNA表达均显著升高(P<0.01)。见表4。

表4 各组骨组织Mst2、Lats1、Taz mRNA表达

3 讨论

绝经后骨质疏松症属中医“骨痿”范畴，主要由于绝经后妇女肾精不足、生髓乏源、骨失滋养所致，是一种与增龄相关的疾病[2]，防治应采用补肾填精壮骨法。

金·刘完素《素问病机气宜保命集》卷下记载“金刚丸”(萆薢、杜仲[炒去丝]、苁蓉[酒浸]、菟丝子[酒浸]各等分，上药为细末，酒煮猪腰子为丸)，功能填精补肾、强筋壮骨，主肾损骨痿，不能起于床。明·楼英《医学纲目》和明·王肯堂《证治准绳·类方》中亦有相关记载。近年研究表明，金刚丸可提高骨矿含量和雌激素水平，通过双向调节PMOP骨形成与骨吸收的代谢失衡而起到治疗作用[3-4]。中医古籍和现代文献均表明金刚丸可有效治疗PMOP，但关于其作用机制的研究颇少。本研究深入探索了金刚丸防治PMOP的作用机制，为其临床推广应用、进一步阐明补肾填精法防治PMOP的作用机制提供了科学的实验依据，具有重大意义。

近年，首次在果蝇体内发现、进化上高度保守[10]的细胞生命活动重要调节器-Hippo信号通路调控骨代谢的机制研究颇受关注[5-6]。哺乳动物的经典Hippo信号通路核心成员包括[11]：哺乳动物sterile 20样激酶(mammalian sterile 20-like protein kinase,MST)1/2及其支架蛋白SAV1、大肿瘤抑制因子(Large tumor suppressor homologue,LATS)1/2及其支架蛋白MOB1、Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)/具有PDZ结合域的转录共激活因子(Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif, TAZ)，MST1/2激酶磷酸化激活，与SAV1形成复合体，从而磷酸化结合MOB1的LATS1/2激酶，进而磷酸化YAP/TAZ，结合细胞质中的14-3-3 蛋白而滞留在胞质中，泛素化后被蛋白酶降解[12-13]。如果Hippo信号通路被抑制，未磷酸化的YAP/TAZ则可进入细胞核，结合其他转录因子，共同促进靶基因转录[14]。

研究[15-17]表明，Hippo信号通路的TAZ结合成骨分化关键转录因子RUNX2，共促进下游成骨靶基因转录，促进骨髓间充质干细胞成骨分化；该通路亦可通过介导Wnt信号通路而调控成骨细胞的增殖和分化[18-19]。TAZ是成骨细胞分化重要的分子标记，给予骨质疏松症模型动物口服TAZ调制剂TM-25659，可减少骨量丢失，提高骨密度[8]。Mst2是调节成骨细胞与破骨细胞二者功能平衡的重要基因，缺乏Mst2基因的小鼠有骨质疏松表型表现[7]。因此，Hippo信号通路对骨质疏松症的发生、发展起到重要作用，Mst2、Taz有望成为防治骨质疏松症新的有效靶点，但目前中医治法及相应复方通过调控该信号通路进而防治PMOP的机理研究尚未见到文献报道。

本研究中的模型组骨密度显著降低、骨微结构显著破坏、骨形成标志物血清ALP显著降低，验证了PMOP大鼠模型复制成功。摘除双侧卵巢导致PMOP模型大鼠骨组织Hippo信号通路Mst2、Lats1转录上调，可能导致MST2、LATS1翻译、磷酸化加快，级联磷酸化TAZ而使其滞留在胞质中被降解；通路Taz转录下调，可能导致TAZ翻译减慢，均可使TAZ入核减慢，而抑制其结合核内成骨分化关键转录因子RUNX2共同促进下游成骨靶基因(如碱性磷酸酶、骨钙素等)转录的功能，抑制成骨细胞分化和成骨，从而导致骨质疏松。具有填精补肾、强筋壮骨功效的中、高剂量金刚丸均使PMOP模型大鼠离体股骨骨密度显著升高、骨微结构显著改善、骨形成标志物血清ALP显著升高，从而有效防治PMOP。其部分疗效机制是中、高剂量金刚丸均使PMOP模型大鼠骨组织Hippo信号通路Mst2、Lats1转录下调，可能导致MST2、LATS1翻译、磷酸化减慢，从而减慢磷酸化TAZ而促进其转位入核；使通路Taz转录上调，可能导致TAZ翻译加快，均可使TAZ入核加快，结合RUNX2，共同促进下游成骨靶基因(如碱性磷酸酶、骨钙素等)转录，促进成骨细胞分化和成骨，从而有效防治PMOP。

本研究表明，骨组织Hippo信号通路核心基因Mst2、Lats1 mRNA表达上调、Taz mRNA表达下调可能是PMOP的发病机制之一；金刚丸可能通过下调骨组织Hippo信号通路核心基因Mst2、Lats1 mRNA表达、上调Taz mRNA表达的机制，有效防治PMOP。本研究丰富了“肾藏精生髓主骨”这一中医理论的科学内涵，并为防治PMOP提供了新的有效靶点。未来可以进一步从Hippo信号通路的上游调控因子乃至胞外信号着手，深入探索中医药防治PMOP的作用机制。