糖皮质激素通过nr3c1受体依赖和非依赖途径介导骨质疏松症的机制

袁涛 姜宇

1.南京医科大学附属无锡第二人民医院骨科，江苏 无锡 214002

2.南京医科大学附属无锡第二人民医院全科医学科，江苏 无锡 214002

糖皮质激素(glucocorticoids，GCs)类药物通常用于治疗多种疾病，包括炎症和自身免疫性疾病[1]；然而长期使用GCs会引起骨组织损伤，最终导致糖皮质激素性骨质疏松症(glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP)[2]。骨质疏松症是一种全身性骨病，其特征是骨密度降低，骨组织微结构破坏，导致骨脆性增加、骨折风险增加[3]。GIOP是最常见的由药物引起的骨质疏松症类型，也是第二大常见的骨质疏松症类型[4]。强的松龙(PN)是一种糖皮质激素类药物，具有强大的抗炎和免疫抑制特性[5]。文献报道，长期使用PN会导致骨密度下降和骨丢失，从而导致骨质疏松症[6]。在细胞内，GCs及其类似物通过GC受体(GR，也称为nr3c1)调节下游基因的表达。

斑马鱼是一种优秀的模型生物，并已成功应用于各种生物医学研究[7]。本研究利用CRISPR/Cas9技术成功地建立了斑马鱼nr3c1-突变体，用于研究斑马鱼的骨矿化和骨代谢相关基因的表达，同时评价了nr3c1在骨代谢相关基因表达调控中的作用。

1 材料与方法

1.1 斑马鱼养殖与培养

成年AB品系斑马鱼在28 ℃、14 h/10 h的光/暗周期下，在循环水系统中饲养，每天投喂3次。为了获得胚胎，将雄性和雌性斑马鱼在晚上配对，第2天在开灯后1 h内雌性斑马鱼产卵。将胚胎放入10 cm厚的培养皿中，并用亚甲基蓝(0.3 ppm)加鸡蛋水，在28 ℃的光控(14 h/10 h明/暗)培养箱中培养。

1.2 nr3c1突变斑马鱼的选育

本研究利用CRISPR-Cas9技术建立nr3c1-突变体。本研究在第2外显子设计靶位点，并在体外合成nr3c1 gRNA，然后将nr3c1 gRNA(100、50和25 pg)和Cas9-Capped-mRNA(300 pg)在单细胞阶段共注射到斑马鱼胚胎中。然后将注射的胚胎保存在28.5 ℃的E3培养基(5 mmol/L NaCl、0.17 mmol/L KCl、0.33 mmol/L CaCl2和0.33 mmol/L MgSO4)中，并在2 DPF下提取3组(每组10个胚胎)的gDNA，然后扩增出含有nr3c1靶位点的243bp DNA片段，用T7内切酶I(New England Biolabs)将7 μL扩增产物在37 ℃下酶切3 h。用美国国立卫生研究院的ImageJ定量分析裂解带和未裂解带的强度，并估计突变频率。将PCR产物克隆至pMD-19 T(Takara Bio Inc.)用于测序分析。为了鉴定胚系传递的突变，将显微注射的鱼胚胎(F0)培育到成年，然后将F0鱼与WT斑马鱼进行异型杂交，产生F1胚胎。然后从每个杂交组合中收集10个F1胚胎进行gDNA提取和酶消化。携带可遗传突变的F1胚胎的同胞被培育到成年，并通过PCR扩增和剪鳍DNA测序重新鉴定了每一条F1鱼。

1.3 阿尔新蓝染色及全标本包埋骨骼染色

为了观察受精后96 h胚胎前骨骼的发育变化，用立体显微镜获取图像(Leica，Wetzlar，Germany)，并用阿尔新蓝染色，重复3次。用Image J测量颅间距离(ICD)、下颌骨长度(LJL)和颈椎软骨长度(CCL)。

斑马鱼幼体的茜素红染色实验如前所述[8]。用立体显微镜(Leica)采集图像。本研究进行了数字图像分析，以量化染色区域的表面和密度。

1.4 斑马鱼样品RNA提取、cDNA合成及qRT-PCR

用Trizol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)提取30多条幼体的总RNA，用SuperScriptTMⅢ逆转录酶(Invitrogen)逆转录成cDNA。反应条件为95 ℃、10 s和60 ℃、30 s，进行40个循环。以看家基因β-肌动蛋白为对照，所有结果均标准化为该基因的表达水平。

1.5 蛋白质印迹分析

对来自WT和nr3c1-/-样本的约100条幼体进行了蛋白质印迹分析。

1.6 荧光素酶报告测定

将mmp9、alp和acp5a启动子克隆到pGL4.17载体中，构建mmp9、alp和acp5a-Luc载体，并与nr3c1表达载体共转染HEK 293 T细胞进行双荧光报告实验。

1.7 统计学分析

数据以平均值±SD表示。两组或更多组之间的统计差异分别使用t检验和单因素方差分析，然后进行Student-Newman-Keuls检验。所有实验至少重复3次。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 nr3c1缺失突变斑马鱼的选育

在斑马鱼中，糖皮质激素受体由nr3c1基因编码，该基因包含9个外显子。起始密码子ATG位于第二外显子，编码蛋白由746个氨基酸组成。在与ATG位点相邻的第二个外显子上预测并选择了该基因上的gRNA靶位点(图1A)。诱变效率实验结果表明，注射100、50和25 pg的gRNA组的效率分别为90%、87%和88%(图1B)。将PCR片段克隆到测序载体PMD-19 T后，单克隆测序显示F0中nr3c1 gRNA靶点有4种不同类型的插入突变(图1C)。因此，这些显微注射的F0胚胎的同胞被培育到成年，并与WT鱼杂交产生F1胚胎。获得了两个可遗传突变，即5-bp缺失和7-bp缺失，并与含有相同突变的F1鱼杂交，获得纯合子nr3c1突变系(图1 D、1E)。Western blotting结果表明，在nr3c1-突变体中未检测到NR3C1蛋白(图1F)。这些结果表明该nr3c1-突变体是一个无义突变体。

2.2 nr3c1-突变体的软骨发育异常

对4 DPF、5 DPF和6 DPF斑马鱼幼体的软骨进行阿尔新蓝染色，结果表明，4 DPF时，PN组、nr3c1突变组和nr3c1突变PN处理组与WT组相比，头面部软骨发育明显减慢(图2A～2 D)，尤其是nr3c1突变PN处理组，难以观察到Meckels软骨(图2 D)。5 DPF时，将主要软骨结构染色，PN组和nr3c1突变PN组与WT组比较，前侧筛板、外侧缘McGills软骨、舌内侧软骨和后角形态无明显差异(图2E～2 H)。然而，nr3c1突变组体现出角质支气管部和角质膜形成的延迟(图2 G)。6 DPF时，各组颅面软骨清晰可见，软骨形态无明显变化(图2I～2 L)。为了进一步评估软骨的发育变化，测量了6 DPF斑马鱼幼体的软骨距离，即颅内距离(ICD)、下颌长度(LJL)和角软骨长度(CCL)(图3A)。PN处理没有影响软骨与对照组之间的距离(图3B～3 D)；相反，在nr3c1突变体中，软骨发育距离显著缩短，表明nr3c1突变导致了头面部骨骼变小(图3B～3 D)。此外，用PN处理nr3c1-突变体后，3个参数没有显著差异(图3B～3 D)。为了探讨颅面骨缺损背后的原因，在6 DPF中计算了颈椎软骨中的软骨细胞数(图4A～4 D)。结果表明，nr3c1突变体的软骨细胞数量显著减少(图4E)。这些结果表明，nr3c1的缺失影响软骨的发育，而PN影响软骨发育的具体机制尚需进一步研究。

图2 nr3c1-突变体的软骨异常 WT组(A、E、I组)、25 μmol/L PN处理组(B、F、J组)、nr3c1-/-突变组(C、G、K组)和25 μmol/L PN处理的nr3c1-/-突变组(D、H、L组)受精后4～6 d进行软骨阿尔辛蓝染色。

图3 nr3c1-突变体软骨长度异常

图4 nr3c1的突变减少了软骨细胞的数量 WT组(A)、PN处理组(B)、nr3c1-/-组(C)和PN处理的nr3c1-/-组(D)显示角软骨发育情况；E为计算软骨细胞的数量。

2.3 nr3c1-突变体骨矿化减少

取7 DPF、8 DPF、9 DPF的幼鱼进行茜素红染色(图5A)，结果显示，在7 DPF，与WT相比，PN处理导致骨矿化显著减少(图5B)，nr3c1突变组显示骨矿化显著减少(图5C)，nr3c1突变与PN处理导致更严重的骨矿化减少(图5 D)。在8 DPF和9 DPF，PN处理和nr3c1突变后的骨矿化表型更为明显(图5E～5 L)。用Image J测量矿化面积，结果表明，在PN处理后和nr3c1-突变体中，矿化面积在7 DPF(图6A)、8 DPF(图6B)和9 DPF(图6C)处与对照组相比显著减少。这些结果表明，nr3c1的缺失和PN处理均会影响斑马鱼幼体的骨矿化。

图5 nr3c1-突变体组和PN处理的nr3c1-突变体组的骨矿化 受精后7～9 d的斑马鱼幼体用茜素红在(A、E和I) WT、(B、F和J) PN处理组、(C、G和K) nr3c1-突变体组和(D、H和L) PN处理的nr3c1-突变体组中染色。

图6 nr3c1-突变体组和PN处理的nr3c1-突变体组中骨矿化的定量分析

2.4 nr3c1-突变体骨代谢相关基因表达模式的改变

为了探究nr3c1对骨发育影响的机制，采用qRT-PCR方法检测了nr3c1-突变组和PN处理组的骨代谢相关基因的表达水平。结果表明，nr3c1-突变体的nr3c1基因表达较WT组下调。在PN处理组，nr3c1表达下调，但不显著(图7A)。

研究表明，mmp9、mmp13和sparc参与细胞外基质(ECM)功能，并通过影响ECM代谢参与骨代谢[9-10]。mmp9和mmp13在以前的研究中已经被确定为PN的靶基因，这两个基因的表达在PN处理后显著增加(图7B)。mmp9和mmp13的表达与WT中没有显著差异，而在nr3c1突变体、5 DPF和8 DPF幼体中，这两个基因的表达降低(图7B、7C)。在WT和nr3c1-突变组中，PN在5 DPF后上调sparc的表达。与野生型相比，nr3c1-突变体的sparc表达无显著差异。在8 DPF时，sparc的表达水平在4个样本组之间没有显著差异(图7D)。

runx2b、entpd5a、spp1和alp是涉及骨代谢的成骨细胞相关基因[11-12]。qRT-PCR结果显示，与对照组相比，nr3c1-突变体中的成骨细胞分化基因runx2b的表达不受PN处理的影响(图7E)。在5 DPF和8 DPF，PN治疗后entpd5a的表达与对照组相比没有显著变化(图7F)。在nr3c1-突变体中，entpd5a的表达水平显著下调，PN没有改变其在nr3c1-突变体中的表达(图7F)。在nr3c1-突变体中，spp1的表达在5 DPF时表达降低，但差异不显著(图7G)。在8 DPF时，与WT相比，nr3c1-突变体中spp1的表达水平显著下调，而PN并不改变nr3c1-突变体中的这种下调(图7G)。碱性磷酸酶(ALP)是成骨细胞的标志物。在5 DPF时，PN没有诱导alp的表达，而在8 DPF时，PN显著增加了alp的表达(图7H)。与WT组相比，在5 DPF和8 DPF nr3c1-突变体中，alp的表达下调，而在nr3c1-突变体中，PN上调了alp的表达，但其水平没有达到WT组的水平(图7H)。

ctsk、acp5a、rankl和opg与骨代谢过程中的破骨细胞有关[13-15]。qRT-PCR结果显示，与WT组相比，PN处理组ctsk在5 DPF时表达上调，在nr3c1-突变体中表达上调(图7I)。在8 DPF时，PN处理不改变ctsk的表达。在nr3c1-突变体中，ctsk的表达水平显著下调，并不受PN的影响(图7I)。与WT组相比，nr3c1突变体中acp5a的表达下调，PN在5 DPF时促进了nr3c1-突变体中acp5a的下调(图7J)。rankl和opg是两个功能相反的配体，它们分别编码激活和抑制破骨细胞分化的蛋白。在5 DPF时，PN处理组和nr3c1-突变体的两个基因表达下调。PN处理组5 DPF时rankl和opg的表达水平与WT组相比无显著差异，而在8 DPF时，nr3c1-突变体的rankl和opg表达水平较WT组明显下调。在nr3c1-突变组，PN上调了opg的表达，但不影响ranklL的表达(图7K～7L)。以上数据表明，nr3c1影响斑马鱼破骨细胞及成骨细胞相关基因的表达。

图7 nr3c1突变改变骨代谢相关基因的表达(用25 μmol/L PN处理WT和nr3c1突变胚胎，并在受精后第5天和第8天收集)

2.5 GC-NR3C1介导的骨相关基因表达

双荧光报告实验结果表明，PN或nr3c1单独上调mmp9的表达，PN可进一步增强mmp9的表达(图8A)。对碱性磷酸酶(alp)表达的分析显示，与mmp9的结果相似(图8B)。单独使用PN并不能显著上调acp5a，而单独添加nr3c1则显著上调acp5a。PN和nr3c1的加入增强了acp5a的这种上调表达(图8C)。这些结果表明PN和NR3C1协同调节骨代谢相关基因的表达。

图8 PN通过nr3c1调节骨代谢相关基因的表达(双荧光素酶报告分析PN和nr3c1对骨代谢相关基因表达的影响)

3 讨论

Paul等[16]发现PN显著促进颅面骨的发育。本研究结果表明，PN对颅面骨发育没有影响，这可能是由于PN浓度不同所致。然而，在nr3c1-突变体中，每个软骨参数都显著降低，这表明nr3c1的缺失抑制了颅面骨的发育。此外，25 μmol/L PN改变了由nr3c1缺失介导的软骨表型。这一结果表明，过量的GC可以部分补偿nr3c1信号通路的缺失(糖皮质激素受体非依赖性通路)。

骨矿化是成骨细胞成熟和骨形成的重要过程[17]。在骨矿化涉及的蛋白质中，entpd5a可以调节磷酸盐的稳定性[18]。根据定量结果，在nr3c1-突变体中entpd5a的表达显著下调，但PN单独不能抑制其表达，表明NR3C1是通过entpd5a途径参与骨矿化的介质之一。在斑马鱼nr3c1-突变体中，spp1的表达显著下调，表明nr3c1也可以通过spp1影响骨矿化。先前的研究发现，高浓度的PN会抑制斑马鱼成骨细胞的分化和数量[19]。在小鼠中，nr3c1被发现降低成骨细胞分化和相关基因的表达[20]。因此，成骨细胞是nr3c1发挥作用的靶细胞，并对骨代谢产生影响，但nr3c1如何调控entpd5a和spp1从而影响骨矿化尚需进一步分析。

破骨细胞能够吸收骨组织，在骨重建中发挥重要作用[15]。先前的动物和细胞实验表明，GCs可以促进破骨细胞分化，并会导致GIOP[21]。然而，在斑马鱼中，PN被发现可以减少破骨细胞数量并增加凋亡[19]；在小鼠中，破骨细胞可以通过GR介导的途径走向凋亡，随后的研究表明PN可以抑制破骨细胞相关基因的表达。本研究发现在nr3c1-突变体中ctsk、acp5a、rankl和opg表达下调，表明nr3c1可以调节许多破骨细胞基因的表达。RANKL/OPG比例对破骨细胞分化至关重要[22]。而GR-二聚体是RANKL/OPG轴的重要调节因子[23]。定量结果表明，OPG和RANKL都是nr3c1的靶基因。本研究未对nr3c1-突变体中RANKL/OPG的比例进行统计分析，该比例是否影响成骨细胞的分化和增殖还有待进一步分析。

在细胞核内，激活的nr3c1以二聚体的方式与GRE元件或其他转录因子结合，以调节基因表达。在本研究评估的基因中，GC/Nr3c1可以通过4种方式调节与骨代谢有关的基因的表达。第一种途径是通过GC-Nr3c1途径，涉及mmp13、mmp9和alp。其次，在nr3c1突变的情况下，GC可以通过多种途径调节骨代谢相关基因的表达，例如sparc。第三，nr3c1调控基因的表达与GCs无关，如entpd5a、spp1、acp5a、opg和rankl。第四，GC调节基因的表达既可以通过nr3c1途径，也可以通过非nr3c1途径，如alp。GC-Nr3c1途径是GN发挥调节骨代谢相关基因作用的经典途径，主要通过调节细胞外基质从而影响骨结构和骨相关细胞的微环境。在nr3c1突变的情况下GC也可通过非nr3c1途径发挥调节作用，如cAMP反应元件结合蛋白、激活蛋白(AP)-1、核因子-κB等。

4 结论

本研究利用CRISPR/Cas9技术成功地获得了斑马鱼nr3c1-突变体。利用该模型发现Nr3c1影响软骨发育和骨矿化，并且Nr3c1突变改变了细胞外基质、成骨细胞和破骨细胞相关基因的表达。进一步的实验表明，GC/Nr3c1通过Nr3c1依赖和非Nr3c1途径调控细胞外基质、成骨细胞和破骨细胞相关基因的表达。本研究为确定Nr3c1在骨代谢和发育中的作用提供了依据，同时为临床治疗糖皮质激素性骨质疏松症确定了新的效应靶点。