骨质疏松症大鼠模型生物力学性能和OPG/RANKL/RANK信号通路研究

李晓婷 张悦瑶 王海豪 唐宏宇

1. 广州中医药大学，广东 广州 510405

2. 广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州 510405

3. 广州中医药大学第一附属医院三骨科，广东 广州 510405

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是以骨量降低、骨微观结构退化为特征的一种疾病[1]。如今全球OP患者人数已超过两亿，在常见病发病率排行中，OP位于第7位[2]。如何有效防治OP已成为国际上共同的公共卫生问题[3]。

目前临床上西医治疗OP的药物包括维生素D、辛伐他汀等[4]，这些药物在长期使用过程中，其副作用会逐渐显露，如导致肌肉酸痛、恶心呕吐、加重肝脏负担、增加罹患乳腺癌等疾病的发生率等[5-7]。近年来中医药对OP的预防作用及对其病情发展的延缓作用已得到肯定，但具体起效的作用机制尚未完全明确[8]。针刺具有促进骨形成、改善骨代谢等作用，但相关作用机制依旧值得深入探究[9]。

研究[10-11]显示OPG/RANK/RANKL通路是骨代谢疾病产生的主要机制。故本文拟通过研究针刺对OP模型大鼠的生物力学性能和OPG/RANKL/RANK信号通路的影响，进而明确针刺防治OP的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1仪器：ZF-208凝胶成像(恒勤仪器设备有限公司，上海)；医用离心机(Beckman公司，美国)；Dexa Pro-1型双能X射线骨密度仪(GE公司，美国)；JS-Power300型电泳仪(迪奥生物科技有限公司，上海)；毫针(Hwato，0.25 mm×13 mm)，HANS-200A 电针仪(南京济生)。

1.1.2药品与试剂：阿仑膦酸钠片(C14202011827，批准文号：国药准字J20130085；规格：70 mg/片，Merck Sharp & Dohme Italia SPA)；OPG检测试剂盒(百奥莱博科技有限公司，北京，批号：ZN2789)；血清Ca2+、P的ELISA试剂盒(百奥莱博科技有限公司，北京，批号分别为：ZN2746、ZN2731)；Western blotting试剂盒(批号：ED1963r)、羊抗鼠RANK多克隆抗体(批号：sc-374360，Santa Cruz Biotechnology)、羊抗鼠RANKL多克隆抗体(批号：sc-377079，Santa Cruz Biotechnology)、羊抗鼠OPG多克隆抗体(批号：sc-390518，Santa Cruz Biotechnology)、HRP标记的羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)二抗(批号：jx-1932，纯度：>95 %)、羊抗鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)多克隆抗体(批号：sc-47724，Santa Cruz Biotechnology)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(批号：ED2571r)均购自广州辉旺生物科技有限公司。

1.1.3实验动物：50只6月龄的健康SD大鼠，SPF级，雌性，体质量为160～200 克，由广州中医药大学实验动物中心提供[实验动物生产合格证编号：SCXK(粤)2018-0034]。动物实验室温度为(22±2)℃、相对湿度50 %。本研究已获广州中医药大学动物伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1分组、造模与给药：将大鼠随机分为手术组(40只)和假手术组(10只)。对其进行为期4 d的适应性饲养后，将手术组大鼠采用双侧卵巢摘除法建立OP模型[12-13]，术后正常饲养，2个月后开始药物干预，连续给药12周。将手术组大鼠随机分为模型组、针刺低剂量组、针刺高剂量组以及阿仑膦酸钠组，假手术组大鼠作为空白组；阿仑膦酸钠组根据人与大鼠体表面积换算给予阿仑膦酸钠片[7.35 mg/(kg·d)]灌胃治疗；假手术组、模型组、针刺低剂量组和针刺高剂量组均给予灌胃等量的生理盐水(给药体积均为1 mL/100 g)；针刺低剂量组和针刺高剂量组按文献[14]取穴，针刺低剂量组：暴露相关穴位(“肾俞穴”及“足三里穴”)，定位准确后将毫针快速刺入，连接电针仪，疏密波，其中针刺低剂量组干预时长为15 min，针刺高剂量干预时长为30 min，每日1次。

1.2.2大鼠骨矿含量和骨密度检测：末次给药结束后24 h，注射戊巴比妥至大鼠腹腔，待其麻醉后，处死大鼠，取右侧股骨和第4腰椎进行研究，将右侧股骨置于双能X线骨密度仪器上检测骨矿含量水平。另外，将右侧股骨和腰椎置于X线骨密度仪器下扫描，计算骨密度含量。

1.2.3大鼠血清Ca2+、P和OPG、RANKL、RANK的水平：大鼠血清中Ca2+、P、OPG、RANKL、RANK等水平采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测。从大鼠的腹主动脉取血5 mL，室温放置1 h，然后以3 000 r/min离心20 min，分离血清。具体操作按试剂盒说明书进行。

1.2.4股骨生物力学性能检测：采用三点弯曲测试评估。处死大鼠后，将完整的股骨从大鼠体内取出，置于生物力学万能实验机上，以每分钟2 mm的速度使实验机压头下压，直到股骨受力面出现裂缝。进行数据收集，并测量股骨刚度等数值。

1.2.5大鼠骨组织中OPG、RANKL、RANK蛋白检测：将大鼠处死，取右侧股骨洗净磨碎，加入裂解液后离心，提取待测股骨中各细胞蛋白，用BCA蛋白试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白样品(50 μg)加到 SDS-PAGE凝胶孔内，20 μL/孔，用280 mA 电流转膜1 h。取出PVDF膜，TBST洗3次×5 min，后将膜放入5 %的脱脂奶粉中，并于室温条件下避光密闭储存2 h。封闭结束后，将膜取出，再次用TBST 浸洗3次×5 min，加入OPG、RANKL、RANK的一抗稀释液(稀释度为1∶1 000)，4 ℃储存过夜。加入二抗稀释液(稀释度为1∶200)，室温孵育1h。显色后，成像，并采用Image J v l.5.l软件分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0软件进行收集数据的统计分析。当数据符合正态分布且方差具有同质性时，多个组间比较采用单因素方差分析。若数据不能达到正态分布的要求或方差不具有同质性时，则采用非参数检验进行组间比较。

2 结果

2.1 针刺对OP大鼠骨组织中骨矿含量、血清Ca2+和血清P的影响

研究结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠骨组织中骨矿含量、血清Ca2+及血清P水平与明显降低(P<0.01)；与模型组比较，针刺的低剂量组、高剂量组和阿仑膦酸钠组大鼠骨组织中骨矿含量升高(P<0.05、P<0.01、P<0.01)，针刺低剂量组大鼠血清Ca2+和P的表达无明显升高，差异无统计学意义(P>0.05)，针刺高剂量组和阿仑膦酸钠组大鼠血清Ca2+和P的表达明显升高(P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠骨组织中骨矿含量和血清Ca2+、P水平测定结果

2.2 针刺对OP大鼠血清中OPG、RANKL和RANK水平的影响

结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠血清OPG表达明显降低(P<0.01)，血清RANKL和RANK表达明显升高(P<0.01)；与模型组比较，针刺的低剂量组、高剂量组和阿仑膦酸钠阳性对照组大鼠血清OPG的表达较模型组升高(P<0.05、P<0.01、P<0.01)；针刺低、高剂量组和阿仑膦酸钠组大鼠血清RANKL和RANK的表达降低(P<0.05、P<0.01、P<0.01)；与阿仑膦酸钠组比较，针刺高剂量组大鼠血清RANKL和RANK的表达明显上调，差异有统计学意义(P<0.05)，表明针刺抑制骨质疏松大鼠血清RANKL和RANK的表达呈现明显的剂量依赖性。见表2。

表2 各组大鼠血清OPG、RANKL和RANK水平的测定结果

2.3 针刺对OP大鼠右侧股骨最大载荷、股骨刚度及弹性模量的影响

和假手术组比较，模型组大鼠股骨最大载荷、股骨刚度、弹性模量数值明显降低(P<0.01)；和模型组比较，针刺低、高剂量组和阿仑膦酸钠组大鼠股骨最大载荷、股骨刚度的数值升高明显(P<0.05、P<0.01、P<0.01)，表明经过针刺干预后，疗效明显，而针刺低剂量组大鼠弹性模量的数值无明显升高(P>0.05)，针刺高剂量组和阿仑膦酸钠组升高明显(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠生物力学性能测定结果

2.4 针刺对OP大鼠股骨和腰椎BMD含量的影响

和假手术组比较，模型组大鼠股骨和腰椎的BMD含量明显降低(P<0.01)；和模型组比较，针刺低、高剂量组和阿仑膦酸钠组大鼠股骨和腰椎的BMD含量升高明显(P<0.05、P<0.01、P<0.01)，表明经过针刺干预后，疗效明显。见表4。

表4 各组大鼠骨密度测定结果

2.5 针刺对OP大鼠骨组织中OPG、RANKL和RANK蛋白的影响

和假手术组比较，模型组大鼠OPG蛋白表达明显降低(P<0.01)，RANKL、RANK蛋白表达明显升高(P<0.01)；和模型组比较，针刺低、高剂量组和阿仑膦酸钠组的OPG蛋白表达升高(P<0.05、P<0.01、P<0.01)，RANKL、RANK蛋白的表达降低(P<0.05或P<0.01)；和阿仑膦酸钠组比较，针刺高剂量组大鼠OPG蛋白的表达明显上调，差异有统计学意义(P<0.05)，而RANKL、RANK蛋白的表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表5，图1。

表5 各组大鼠骨组织中蛋白的相对表达量测定结果

图1 各组大鼠骨组织中OPG、RANKL、RANK蛋白表达电泳图

3 讨论

关于OP，中医并没有相对应的病名，根据其临床表现，可将其归属于“骨痿”的范畴[15]。主要病因有：肾虚精亏、脾虚导致气血生化不足等[16]。在临床中，OP的中医治法以补肾健脾为主[17-21]。阿仑膦酸钠是临床治疗OP的一线药物[22]，故本研究以阿仑膦酸钠为阳性药对照，评价针刺治疗OP的疗效。有研究[23-24]表明“肾俞穴”“三阴交穴”“关元穴”及“足三里穴”是补肾健脾重要穴位，可增强骨密度，对于OP的生理病理有重要的影响，但具体作用机制未明确。

OPG/RANK/RANKL信号通路在调节成骨细胞(osteoblast，OB)与破骨细胞(osteoclast，OC)的成熟与分化过程中起到重要作用，该通路通过维持、调控OB与OC间动态平衡影响OP的发生与发展[25-26]。在骨组织中，OB分泌的OPG为RANKL的高亲和力诱饵样受体，与RANKL有较强结合能力，故OPG可减少 RANKL与破骨细胞分化因子受体RANK的结合，影响RANK-RANKL途径，使OC转录活化信号生成减少，从而抑制OC生成和成熟，并降低OC的活性[27]。若机体RANKL表达水平增高，OPG表达水平下降，则RANKL与RANK结合受到促进，OB收到RANK-RANKL途径产生的转录活化信号，刺激前破骨细胞分化为OC，从而促进OC的形成、分化、成熟，进而促进骨吸收量的增加，最终导致骨组织损伤，以及OP的发生[28]。

本研究结果显示，针刺可升高OP模型大鼠股骨骨矿、血清Ca2+和P含量，对股骨有明显改善作用，表明针刺增加了OP模型大鼠的骨矿含量，减少了钙、磷丢失，改善了生物力学性能；同时，针刺可以通过调控OPG/RANKL/RANK途径的传导，对OC的增殖分化产生抑制作用，进而降低OP模型大鼠的骨吸收量，减少Ca2+、P丢失，间接达到增加骨骼骨矿含量的效果，从而达到降低或延缓OP的发生发展。

综上所述，针刺能够通过上调OPG表达，阻碍RANKL-RANK途径的表达，降低OC的生成，从而增加骨形成量，降低骨吸收量，进而达到减少钙磷丢失、提高骨骼骨矿含量、改善骨骼生物力学性能的效果。