HBV感染者血清M-CSF、DNMT1和PD-1水平与疾病进展的相关性*

向 焰，向 婷，张正娟，李 溶

广元市精神卫生中心检验科，四川广元 628000

乙型肝炎病毒(HBV)感染是世界上一个非常严重的公共卫生问题。目前，全世界约有2.5亿HBV感染者，HBV感染后如果不及时治疗，会造成肝细胞反复损伤，逐渐发展为慢性乙型肝炎(CHB)，增加肝硬化和肝癌的风险，严重威胁患者的生命安全和健康[1]。肝活检是诊断乙型肝炎肝硬化的金标准，但其具有侵入性和无法重复检查的缺点，在疾病监测和疗效评定方面有一定的局限性[2]。传统的影像学检查对乙型肝炎肝硬化的早期诊断价值较低，对晚期出现并发症患者往往具有较高的敏感性和特异性，但延误了最佳治疗时机[3]。血清学指标具有检测方便、快速、廉价等优点，受到临床研究者的高度关注[4]。巨噬细胞是肝脏炎性反应的主要效应细胞，能调节、聚集和激活肝星状细胞。巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)介导炎症和免疫反应，参与肝硬化的病理过程[5]。DNA甲基转移酶1(DNMT1)是人类细胞中含量最多的甲基转移酶，能维持DNA甲基化；DNMT1的异常表达会破坏基因组的稳定性，在许多疾病的发生、发展中起重要作用[6]。程序性死亡受体1(PD-1)是近年来发现的一种相对分子质量为55 000的Ⅰ型跨膜蛋白，其是CD28家族的一员，能与程序性死亡配体-1结合，阻断CD28介导的磷酸肌醇-3激酶途径的激活，进而抑制T细胞的增殖和分化，降低T细胞的功能[7]。本文拟分析不同疾病进展期HBV感染者血清M-CSF、DNMT1和PD-1水平差异及其相关性，旨在为临床诊断和治疗HBV感染提供新的方法和参考依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取本院2019年1月至2020年1月收治的108例HBV感染者作为研究对象，根据肝组织病理检查结果判断CHB的严重程度，并将其分为A组(无症状HBV携带者)20例，B组(轻中度CHB)42例，C组(重度CHB)16例，D组(乙型肝炎肝硬化)30例。另选取同期行健康体检的30例健康人作为对照组。HBV感染者纳入标准：(1)符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[8]中CHB的诊断标准；(2)一般资料完整；(3)存在乙型肝炎病史；(4)大于半年的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性。对照组纳入标准：肝功能指标正常且乙型肝炎表面抗体(HBsAb)阳性，其余HBV血清学标志物及HBV基因检测结果均无异常。排除标准：(1)合并其他类型病毒性肝炎；(2)存在酒精、药物和自身免疫性肝病；(3)合并肝脏良、恶性肿瘤；(4)合并严重心、肺、肾等其他脏器疾病；(5)合并其他部位恶性肿瘤。各组性别、年龄、体质量指数比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。本研究经医院伦理委员会批准，所有研究对象对本研究知情同意并签署知情同意书。

表1 各组一般资料比较

1.2方法

1.2.1M-CSF检测 空腹采集各组患者肘静脉血5 mL，静置30 min，采用上海卢湘仪离心机仪器有限公司提供的TG20.5台式高速大容量离心机离心，取上清液，分别置于无菌、无RNA酶的离心管，然后于-80 ℃冰箱冷冻保存备测。采用AutoLumo A1000全自动化学发光免疫分析仪，以放射免疫法检测血清M-CSF水平，试剂盒购自上海纪宁实业有限公司。

1.2.2DNMT1检测 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组受试者血清DNMT1水平。采用纯化的人DNMT1抗体包被微孔板，将DNMT1加入包被的微孔板中，与辣根过氧化物酶标记的DNMT1抗体结合形成抗体-抗原-酶标记的抗体复合物，加入底物3，3′，5，5′-四甲基联苯胺，3，3′，5，5′-四甲基联苯胺在辣根过氧化物酶催化下呈蓝色，在酸的作用下液体呈黄色，颜色深浅与DNMT1水平呈正比。用微孔板读卡器测量450 nm处的吸光度，用标准曲线计算DNMT1水平。

1.2.3PD-1检测 取各组受检者的新鲜乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血，加入PD-1单克隆抗体或相应的同型对照抗体(上海纪宁实业有限公司)，于4 ℃避光孵育20 min，然后添加500 μL的红细胞裂解液(北京索莱宝科技有限公司)，再于4 ℃避光孵育10 min，并添加1 000 μL磷酸盐缓冲液，500×g离心5 min，洗涤后用流式细胞仪(常州必达科生物科技有限公司)检测血清PD-1水平。

2 结 果

2.1各组血清M-CSF、DNMT1和PD-1水平比较 血清M-CSF、DNMT1和PD-1水平由高到低依次为D组、C组、B组、A组、对照组，各组血清M-CSF、DNMT1和PD-1水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组血清M-CSF、DNMT1和PD-1水平比较

2.2HBV感染者血清M-CSF、DNMT1和PD-1水平与疾病进展的相关性 以疾病进展(定义：“A组”=1，“B组”=2，“C组”=3，“D组”=4)作为因变量，将各组感染者血清M-CSF、DNMT1和PD-1水平作为自变量，纳入多元线性回归模型，结果显示，血清DNMT1和PD-1水平均与HBV感染者疾病进展存在相关性(P<0.001)。见表3。

表3 HBV感染者血清M-CSF、DNMT1和PD-1水平与疾病进展的相关性

3 讨 论

CHB是由HBV长期反复作用引起的弥漫性肝损伤，大量炎性单核细胞聚集在肝脏，进一步分化为促纤维化的巨噬细胞，诱导肝星状细胞、肝巨噬细胞和胞外基质的产生，打破基质产生与降解的平衡，使其在肝脏中积聚，最终涉及多个系统受累，使肝脏变形硬化，进展为肝硬化[9]。乙型肝炎肝硬化早期的主要病变是肝纤维化，是对肝损伤的应激性愈合反应，肝脏结缔组织的增生和沉积是非常普遍的现象。在长期的临床实践中发现，乙型肝炎肝硬化患者的病情程度存在很大差异，一般早期仅出现厌食、身体乏力、肝功能异常等症状，至晚期才出现腹水、门脉高压、肝性脑病等并发症[10]。因此，及时诊断CHB非常重要，临床上需综合、精准地判断CHB病情，为患者及时治疗和改善预后提供参考依据。

M-CSF是由单核-巨噬细胞、成纤维细胞、成骨细胞和血管内皮细胞分泌的细胞因子，其能通过与其受体调节单核-巨噬细胞系细胞的分化和增殖。M-CSF作为一种促炎因子，参与了炎性反应。M-CSF表达升高可激活基质金属蛋白酶，促进胶原纤维的沉积，促进炎症因子在肝脏的浸润；M-CSF能抑制自然杀伤细胞合成和分泌抗纤维蛋白，可减少肝星状细胞凋亡，促进肝硬化的进展[11]。DNA甲基化是一种非常重要的表观遗传修饰形式，其中DNA甲基转移酶是DNA甲基化的关键调控因子，DNMT1属于一种DNA甲基转移酶。DNMT1在乙型肝炎中的作用已引起广泛关注。DNMT的表达与HBV感染密切相关。有研究发现，HBV X蛋白的转录激活DNMT1启动子，进而上调DNMT1的表达，DNMT1在CHB患者中过度表达。此外，DNMT1还可以调控CHB患者线粒体DNA甲基化[12]。PD-1是一种跨膜蛋白，存在于程序性死亡T细胞中，可诱导其在活化的CD4+和CD8+T细胞上表达。相关研究表明PD-1能抑制T细胞，诱导免疫耐受，PD-1与程序性死亡配体-1结合可增强T细胞线粒体的氧化反应，提高活性氧和过氧化氢水平，抑制T细胞增殖，诱导细胞凋亡，减弱机体对HBV的免疫应答[13]。

本文研究结果显示，各组血清M-CSF、DNMT1和PD-1水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)，提示随着疾病的持续进展，HBV感染者的血清M-CSF、DNMT1和PD-1水平也会随之发生变化。另外，相关性分析结果显示，疾病进展与HBV感染者血清DNMT1和PD-1水平均存在相关性(P<0.001)。分析原因在于：DNMT1是DNA甲基转移酶家族的成员，DNMT1表达上调使甲基化后宿主基因功能减弱，导致HBV感染加重[14]。PD-1/程序性死亡配体-1通路影响T细胞的增殖和分化，随着PD-1水平的升高，机体的免疫力也随之降低，有助于HBV复制，HBV感染加重，T细胞功能受限加重。长期HBV抗原刺激可诱导PD-1表达上调，通过与同时诱导程序性死亡配体-1高表达形成抑制性信号通路阻断机体的强免疫反应，导致病毒的活跃复制和疾病的持续性[15]。HBV感染疾病进展的不同阶段，患者的机体免疫状态存在差异性，PD-1的表达水平也不同。有研究发现，免疫耐受组和非活动携带组CD8+T细胞PD-1表达均高于免疫清除组(P<0.05)，提示PD-1表达水平可反映机体的免疫功能状态[16]。HBV感染的免疫活化阶段CD8+可以下调PD-1的表达，激活T细胞增殖，从而清除病毒；HBV还可通过此通路上调PD-1，抑制T细胞活化应答，使病毒持续感染[17]。MADEDDU等[18]研究发现，CHB患者DNMT1可调节线粒体DNA甲基化状态，表明DNMT1参与乙型肝炎的发病过程。薛立芝等[19]研究发现，乙型肝炎组血清DNMT1水平高于对照组，乙型肝炎e抗原(HBeAg)阳性组DNMT1水平高于HBeAg阴性组，CHB患者血清DNMT1水平与肝组织炎症活动和肝纤维化存在紧密的关系，DNMT1可能参与CHB的发病过程，血清DNMT1水平可反映肝功能损伤、炎症活动及肝纤维化程度等。上述研究与本研究结果基本一致。

综上所述，不同疾病进展期的HBV感染者血清M-CSF、DNMT1和PD-1水平存在差异，且HBV感染者血清DNMT1和PD-1水平与疾病进展存在相关性。