外周血循环肿瘤细胞、人附睾蛋白4、糖类抗原199检测在子宫内膜样腺癌筛查及分期预测中的价值*

游伟强，吴小延，叶才果，王莉平△，林立鹏，薛临先，肖 杨

1.深圳市福田区妇幼保健院检验科，广东深圳518016；2.中山大学肿瘤防治中心分子诊断科， 广东广州 510060；3.广东医科大学广东省医学分子诊断重点实验室，广东东莞523808

子宫内膜癌是一种发生在子宫内膜上皮的恶性肿瘤，以子宫内膜样腺癌最为常见，其在子宫内膜癌中占80%～90%[1]。近年来，子宫内膜样腺癌呈现出发病年龄年轻化、发病率逐年上升的趋势[2]。全球每年新发子宫体癌约25万例，其中约75%为子宫内膜癌。在子宫内膜样腺癌早期，患者可无任何临床症状，即使其最常见的临床表现——阴道不规则流血和阴道分泌物增多，也不具备特异性。阴道超声检查可对子宫内膜样腺癌作出初步筛查，但是误诊、漏诊率较高。磁共振成像(MR)和腹部计算机断层扫描(CT)对于判断子宫内膜样腺癌的转移具有较好的临床价值。传统的血液肿瘤标志物的整体综合诊断性能不足，而诊断性刮宫和宫腔镜下活检是侵入性操作，易对患者的生理和心理产生影响，而且容易导致肿瘤的种植性转移[3]。目前鲜有敏感而特异的无创筛查技术可用于子宫内膜样腺癌的早期诊断及分期预测。

液态活检技术的发展及外周血循环肿瘤细胞(CTC)的发现为解决这一学科难题带来了希望。CTC检测具有无创性、综合效能较高、早于影像学检测和可重复性强等优点。2010年以来，CTC的临床价值陆续得到了国内外众多权威学会和指南的认可，应用于多种癌症的早期诊断、治疗监测、复发监测和指导治疗方案[4]。此外，DEGEZ等[5]研究发现，人附睾蛋白4(HE4)对子宫内膜样腺癌的早期筛查及分期预测可能有一定的参考价值。李小毛等[6]研究认为，术前糖类抗原199(CA199)检测是预测子宫内膜癌的病理高危因素和手术病理分期的良好指标。本研究旨在分析术前CTC、HE4、CA199联合检测在子宫内膜样腺癌筛查和分期预测中的应用价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年3月至2022年1月于中山大学肿瘤防治中心就诊或体检的293例子宫内膜正常体检者(正常组)、359例无非典型性子宫内膜增生患者(良性组)、381例子宫内膜样腺癌患者(恶性组)作为研究对象。正常组年龄24.5～82.6岁，平均(52.9±9.6)岁。良性组年龄22.7～81.2岁，平均(53.1±10.8)岁。恶性组年龄26.5～83.4岁，平均(53.5±11.6)岁。正常组、良性组和恶性组的年龄比较，差异无统计学意义(F=0.28，P=0.76)。纳入标准：年龄20～85岁；子宫内膜为原发病灶；患者依从性好且病历资料详细；无孕激素拮抗的性激素治疗史；未合并其他肿瘤。排除标准：妊娠期、哺乳期女性；有放化疗、免疫治疗史者；合并血液系统严重疾病者；精神疾病患者；因各种原因中途退出研究者。良性组、恶性组的病理诊断依据是2020年第5版世界卫生组织推荐的子宫体癌分类标准[7]。采用2018年国际妇产科联盟推荐的手术病理分期标准[8]，把恶性组381例子宫内膜样腺癌患者分为Ⅰ期(261例)、Ⅱ期(41例)、Ⅲ期(43例)、Ⅳ期(36例)。阳性病例是经病理学检查确诊为子宫内膜样腺癌的381例患者，阴性病例包括293例正常组受试者和359例良性组患者，共652例受试者。

1.2试剂与仪器 CTC检测试剂盒和PathfinderTM全自动智能扫描图像分析系统均购于江苏莱尔生物医药科技有限公司，HE4、CA199检测试剂盒和Cobas E 801电化学发光免疫分析仪均购于罗氏诊断产品(上海)有限公司。

1.3方法 分别于正常组受试者体检时、良性组和恶性组患者术前采集4.0 mL静脉血液标本各2份。一份用于CTC检测，另一份用于HE4、CA199水平检测。(1)CTC检测及结果判读：按照CTC检测说明书操作，采用“阴性富集法”以CS1缓冲液、CS2储存液、CS3分离介质和磁微粒混悬液，3 000 r/min离心8 min，离心半径为15 cm，采用免疫磁微粒技术分离血浆、去除破裂红细胞和白细胞，得到白细胞去除率大于99.99%、CTC回收率大于90%的细胞悬液。借助全自动智能扫描图像分析系统，使用荧光原位杂交技术，排除其他的血源性细胞，鉴定细胞悬液中的CTC。CTC数量在0～1个为正常，判读为阴性，CTC数量在2个及以上，判读为阳性。(2)HE4、CA199检测及结果判读：按照HE4、CA199检测说明书操作，血液标本以3 000 r/min离心8 min，取上层血清液，测定HE4、CA199水平。HE4参考范围为0～140 pmol/L、CA199参考范围为0～27 U/mL。HE4、CA199两项指标检测值大于参考范围上限，定义为阳性。(3)CTC、HE4、CA199联合检测及结果判读：联合检测组合结果判读采用平行试验，即CTC+HE4、HE4+CA199、CTC+CA199、CTC+HE4+CA199检测结果中只要有一个试验为阳性即诊断为该检测组合阳性，全部试验结果都为阴性时诊断为阴性。

2 结 果

2.13组CTC数量及HE4、CA199表达水平比较 3组CTC数量比较，差异有统计学意义(P<0.05)；恶性组CTC数量高于良性组和正常组，差异均有统计学意义(P<0.05)；良性组和正常组的CTC数量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。3组HE4表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；恶性组HE4表达水平高于良性组和正常组，差异均有统计学意义(P<0.05)；良性组和正常组HE4表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。3组CA199表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；恶性组CA199表达水平高于良性组和正常组，差异均有统计学意义(P<0.05)；良性组和正常组CA199表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组CTC数量及HE4、CA199表达水平比较[M(P25,P75)]

2.23组CTC、HE4、CA199单独和联合检测阳性率比较 3组CTC、HE4、CA199单独和联合检测阳性率总体差异均有统计学意义(P<0.05)。恶性组CTC、HE4、CA199单独和联合检测阳性率高于良性组和正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；良性组和正常组HE4、CA199、CTC+HE4、HE4+CA199、CTC+CA199、CTC+HE4+CA199检测阳性率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组CTC、HE4、CA199单独和联合检测的阳性情况比较[n(%)]

2.3恶性组各分期的CTC数量及HE4、CA199表达水平比较 恶性组各分期CTC数量比较，差异有统计学意义(P<0.05)；Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期CTC数量两两比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。恶性组各分期的HE4表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；Ⅰ期与Ⅱ期、Ⅰ期与Ⅲ期、Ⅰ期与Ⅳ期、Ⅱ期与Ⅳ期、Ⅲ期与Ⅳ期HE4表达水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。恶性组各分期的CA199表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 恶性组各分期的CTC、HE4、CA199表达水平比较[M(P25,P75)]

2.4恶性组各分期CTC、HE4、CA199单独和联合检测阳性率比较 恶性组各分期的CTC检测阳性率比较，差异有统计学意义(P<0.01)；Ⅰ期与Ⅲ期、Ⅰ期与Ⅳ期CTC检测阳性率比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。恶性组各分期HE4检测阳性率比较，差异无统计学意义(χ2=1.24，P=0.74)；恶性组各分期CA199检测阳性率比较，差异有统计学意义(P<0.01)；Ⅰ期与Ⅱ期、Ⅰ期与Ⅲ期、Ⅰ期与Ⅳ期CA199检测阳性率比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。恶性组各分期CTC+HE4检测阳性率比较，差异有统计学意义(P<0.01)；Ⅰ期与Ⅲ期、Ⅰ期与Ⅳ期CTC+HE4检测阳性率比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。恶性组各分期HE4+CA199检测阳性率比较，差异无统计学意义(χ2=1.52，P=0.68)。恶性组各分期CTC+CA199检测阳性率比较，差异有统计学意义(P<0.01)。Ⅰ期与Ⅲ期、Ⅰ期与Ⅳ期CTC+CA199检测阳性率比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。恶性组各分期CTC+HE4+CA199检测阳性率比较，差异有统计学意义(P<0.01)；Ⅰ期与Ⅳ期CTC+HE4+CA199检测阳性率比较，差异有统计学意义(P<0.01)。见表4。

表4 恶性组各分期的CTC、HE4、CA199单独和联合检测阳性率比较[n(%)]

2.5CTC、HE4、CA199单独和联合检测对子宫内膜样腺癌的诊断效能 对单因素分析差异有统计学意义的CTC、HE4、CA199检测指标的原始值绘制相应的ROC曲线，在拟合了CTC+HE4、HE4+CA199、CTC+CA199、CTC+HE4+CA199检测的Logistic回归模型后，使用其P值绘制相应检测的ROC曲线。ROC曲线分析结果显示，CTC+HE4+CA199联合检测的曲线下面积(AUC)最大[0.945(95%CI：0.932～0.959)]，检测灵敏度和特异度分别为87.93%、92.79%。CTC、HE4、CA199单独和联合检测子宫内膜样腺癌的ROC曲线及相关参数见表5和图1。

表5 CTC、HE4、CA199单独和联合检测诊断子宫内膜样腺癌的ROC曲线相关参数

图1 CTC、HE4、CA199单独和联合检测诊断子宫内膜样腺癌的ROC曲线

3 讨 论

近年来，子宫内膜癌的病死率每年上升约1.4%，Ⅰ期患者5年生存率约90%，Ⅱ期约40%、Ⅲ期和Ⅳ期则降至20%以下[9]。因此，早期诊断有益于改善子宫内膜样腺癌患者生存率。CHU等[10]研究表明，CTC以不同形态存在于上皮细胞表型、间质细胞表型，以及上皮细胞和间质细胞混合表型。本研究中采用的检测技术能高效进行CTC的鉴定，该技术不依赖CTC的理化特性，能有效将上皮细胞表型、间质细胞表型及混合表型捕获。本文与陈志强等[11-12]研究使用了相同的检测技术。KISS等[13]研究表明，子宫内膜癌患者中CTC的存在提示其总体生存率较差。本研究侧重于探讨CTC在子宫内膜样腺癌筛查和分期预测中的应用价值。

本研究结果显示，3组CTC、HE4、CA199单独和联合检测的阳性率比较，差异有统计学意义(P<0.05)，而且恶性组CTC、HE4、CA199单独和联合检测阳性率均高于良性组和正常组，差异有统计学意义(P<0.01)；3组CTC数量及HE4、CA199表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.01)，恶性组CTC数量及HE4、CA199表达水平均高于良性组和正常组，差异均有统计学意义(P<0.01)。本研究中，表1和表2通过单因素分析，甄选出了CTC、HE4、CA199单独和联合检测中对恶性组筛查有统计学意义的检测组合。这与TINGANELLI等[14]、DEGEZ等[5]、李小毛等[6]研究报道的结论基本一致。本研究联合了CTC液态活检技术与传统的血液肿瘤标志物HE4和CA199这3项检查指标。

本研究从检测阳性率和表达水平两个方面考察CTC、HE4、CA199单独和联合检测对恶性组的分期预测价值，结果显示CTC、CA199、CTC+HE4、CTC+CA199、CTC+HE4+CA199检测阳性率对于甄别恶性组各分期差异有统计学意义(P<0.05)，CTC数量及HE4表达水平对于甄别恶性组各分期差异有统计学意义。本研究中，表3和表4通过单因素分析甄选出了CTC、HE4、CA199单独和联合检测中对恶性组分期具有预测价值的检测组合。ZHANG等[15]检测了78例Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期子宫内膜癌患者血液中的CTC，表明CTC对于子宫内膜癌预后和转移具有预测价值。ESPIAU等[16]研究认为，肿瘤标志物HE4可以预测子宫内膜癌的淋巴结转移情况。AREND等[17]研究发现，CA199对于提示子宫内膜癌的临床分期和淋巴结转移均有一定的临床意义。而本研究正常组和良性组Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期CA199差异的判断与AREND等[17]研究结论有不同之处，可能是由于本文样本量偏小引起的。本研究中，ROC曲线分析结果显示，CTC+HE4+CA199检测的AUC最大，灵敏度、符合率、约登指数等高于其他检测组合。因此，CTC+HE4+CA199对子宫内膜样腺癌的综合诊断价值较高。

由于受研究时间及样本量的影响，本研究结论还需进一步验证。本课题组今后将继续加强与上级医疗机构的合作，扩大样本量，深入研究CTC、HE4、CA199与子宫内膜样腺癌的肿瘤分级、肌层浸润、淋巴结转移及分子分型等的相关性，更好地掌握子宫内膜样腺癌的特征和发生、发展机制，制订个体化诊治方案，造福患者。