粪菌移植对腹泻型肠易激综合征模型大鼠脑-肠轴中5-HT信号通路的影响

欧阳勇文，李兆滔，吕 晋，赵光华，王艺霖，崔西玉△

佛山市第一人民医院：1.消化内科；2.病理科；3.检验科，广东佛山 528000

肠易激综合征(IBS)是一种间歇性或持续性发作、以腹痛、便秘、腹泻为主要特征的肠功能紊乱性疾病[1-2]。根据IBS的症状表现，可分为便秘型、腹泻型(IBS-D)、不定型及混合型，其中IBS-D发病率最高[3-4]。由于其频繁、持续的发作，给患者带来严重的心理障碍、精神异常及经济负担。目前研究认为，IBS-D致病原因主要包括肠道菌落失衡、饮食不规律、内脏高敏感性、感染及脑-肠互动异常等多种因素，其中肠道菌群失衡是IBS-D发生的关键因素之一[5-7]。有研究显示，IBS-D患者与健康人群的粪便菌群存在明显的差异，且菌群分布及功能呈现紊乱状态。因此，调节肠道菌群平衡成为治疗IBS-D的重要研究方向[8]。粪菌移植(FMT)是指将健康供体的粪便菌液通过一定的方式处理后，移植到患者的胃肠道中，通过调节其患者肠道内肠道菌落，重建正常微生态平衡，从而达到治疗作用[9-10]。目前已有研究证实，粪菌移植在改善IBS-D患者症状中具有明显的治疗效果[11]，但其作用机制尚不明确。因此，本研究通过构建IBS-D模型大鼠，围绕脑-肠轴5-HT信号通路，探讨粪菌移植的作用机制，为临床粪便移植的推广使用及新药开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级雄性SD大鼠45只，体重(130±20)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号[SCXK(京)2018-0002]，饲养于实验动物中心，在温度(23±3)℃，光暗12 h/12 h条件下适应性喂养。

1.2试剂 SERT抗体(美国CST公司，批号：7473218)、TPH1抗体(美国CST公司，批号：6802487)、5-HT3R抗体(英国Abcam公司，批号：ab13897)、5-HT4R抗体(英国Abcam公司，批号：ab60359)，5-HT和SP酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海康朗生物科技有限公司，批号：607783、789981)；辣根酶标记荧光二抗(福麦斯有限公司，批号：1125854)，3，3′-二氨基联苯胺(DAB)显色试剂及电泳液等(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.3粪菌液的制备 参考陈梦等[12]制备方法，收集健康大鼠新鲜粪便，置于无菌管中，按照质量/体积1∶5的比例加入生理盐水，充分混合摇匀后，在滤网中过滤，除去大颗粒物质，将滤液3 000 r/min离心10 min，弃上清，再次加入生理盐水，重复上述步骤3次，收集沉淀物，加入生理盐水重悬，即获得粪菌液。

1.4动物分组及模型的制备 将SD大鼠按照随机数字表法分成3组，正常组、模型组及粪菌移植组，每组15只。除正常组外，其他组均进行造模。造模方法如下：采用番泻叶(20 mg/kg)对大鼠进行灌胃，每天2次，同时在每次灌胃后1 h，将大鼠的胸部、前肢及肩部采用透明胶带进行束缚，使其不能行动，诱导大鼠出现躁狂的状态，从而对大鼠造成一定程度的应激刺激，每次束缚2 h，造模时间为连续14 d。造模完成后，采用腹壁撤离反射(AWR)评分标准对模型进行验证，评分达到3分即表示造模成功。造模完成后，对粪菌移植组大鼠采用预先制备好的粪菌液灌肠处理，每次灌肠体积2 mL，对照组和模型组均采用同样的灌肠方法给予灌肠生理盐水，连续灌肠治疗10 d。

1.5标本采集 于大鼠末次粪菌移植治疗后，禁食12 h，乙醚麻醉，股动脉取血，颈椎脱臼法处死，待血液静置30 min后，3 000 r/min离心5 min，分离血清，分装后置于-80 ℃冰箱中备用。同时迅速取出大鼠脑组织和距离肛门3～5 cm 处的新鲜结肠组织(长度1～2 cm)，生理盐水冲洗干净后，一部分置于10%甲醛溶液中固定，其他部分置于-80 ℃冰箱中备用。

1.6观察指标

1.6.1基本情况 观察SD大鼠在治疗期间粪便颜色、气味、性状、腹泻程度、精神状态及进食状况等。

1.6.2粪便含水量 采集同时间段各组大鼠的粪便，称质量后记作湿重，干燥后再称质量记为干重，计算治疗前后各组大鼠粪便含水量的变化。粪便含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.6.3大鼠脑组织及血清5-HT和SP表达水平 取部分大鼠脑组织，按照一定比例加入生理盐水，在冰上研磨，制成匀浆，3 000 r/min离心3 min，收集上清备用。从冰箱中取出大鼠血清，复温，采用ELISA检测大鼠脑组织及血清5-HT和SP表达水平，检测步骤严格依据ELISA试剂盒说明书开展。

1.6.4大鼠结肠组织及脑组织SERT蛋白表达水平 采用免疫组化法检测大鼠结肠及脑组织SERT蛋白表达水平。取出于甲醛溶液中固定好的大鼠结肠组织和脑组织，将其制作成蜡块，切片，将切片置于二甲苯溶液中脱蜡，在不同浓度梯度的乙醇溶液中水化，取出切片后，置于柠檬酸缓冲液中10 min进行抗原修复，滴加H2O2溶液封闭，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗 3次，每次1 min，加入抗体(1∶100)，于4 ℃摇床条件下孵育过夜，PBS清洗清洗 3次，每次1 min，滴加二抗，37 ℃孵育2 h，PBS清洗 3次，每次1 min，加入DAB染色，将切片置于梯度浓度的二甲苯和乙醇溶液中脱水，干燥后封片，置于高倍显微镜下观察，随机选取3个视野，观察蛋白表达情况。

1.6.5大鼠结肠组织和脑组织SERT、THP1、5-HT3R、5-HT4R蛋白表达水平 采用Western blot法检测大鼠结肠组织和脑组织SERT、THP1、5-HT3R、5-HT4R蛋白表达水平。选取各组大鼠结肠组织并进行称量，按照比例加入裂解液提取组织蛋白，BCA法测定裂解液中蛋白浓度，依据测定的蛋白浓度按照比例加入上样缓冲液，置于沸水中煮沸10 min使蛋白变性，获取本后置于-20 ℃冰箱中备用。配制十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶，组织样本上样，电泳，转膜。然后，取出PVDF膜，置于37 ℃摇床中用脱脂奶粉封闭2 h，取出PVDF膜，TPBS冲洗3次，每次5 min，PBS清洗1次，每次3 min，滴加一抗(1∶100)，4 ℃摇床中孵育过夜，TPBS冲洗3次，每次5 min，PBS冲洗1次，每次3 min，置于37 ℃摇床中孵育二抗(1∶50 000)2 h，冲洗，配置显影液后均匀涂抹于PVDF膜上，扫描目的蛋白，采用Image-Pro Plus软件分析蛋白表达水平。

2 结 果

2.1大鼠基本情况 治疗期间，所有大鼠均未发生死亡事件。正常组大鼠饮食、排便状况、机体活动，以及生长状况均表现正常；模型组大鼠在造模后，出现稀便样腹泻、精神状况萎靡、饮水量增加、进食量减少，以及烦躁不安等症状；粪菌移植组大鼠在治疗后，精神状况明显改善，腹泻状况明显好转。

2.23组大鼠粪便含水量比较 模型组大鼠粪便含水量明显高于正常组，粪菌移植组大鼠粪便含水量明显低于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)。见图1。

注：与正常组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01。

2.33组大鼠脑组织及血清5-HT和SP表达水平比较 与正常组相比，模型组大鼠脑组织和血清5-HT和SP表达水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，粪菌移植组大鼠脑组织和血清5-HT和SP表达水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 3组大鼠脑组织及血清5-HT和SP表达水平比较

2.43组大鼠结肠组织及脑组织SERT蛋白表达水平比较 与正常相比，模型组大鼠结肠组织及脑组织SERT蛋白表达水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，粪菌移植组大鼠在粪菌移植治疗后结肠组织及脑组织SERT蛋白表达水平明显升高，差异均有统计学意义(P<0.01)。见图2。

注：免疫组化结果(×200)。

2.53组大鼠结肠组织和脑组织SERT、THP1、5-HT3R、5-HT4R蛋白表达水平比较 与正常组相比，模型组大鼠结肠组织和脑组织SERT、5-HT4R蛋白表达水平明显降低，THP1和5-HT3R蛋白表达水平明显升高，差异均有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，粪菌移植组能SERT、5-HT4R蛋白表达水平明显升高，THP1和5-HT3R蛋白表达水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.01)。见图3、4。

注：A为Western blot检测结果；B～E为相对表达量统计分析结果；与正常组比较，aP<0.01；与粪菌移植组比较，bP<0.01。

注：A为Western blot检测结果；B～E为相对表达量统计分析结果；与正常组比较，aP<0.01；与粪菌移植组比较，bP<0.01。

3 讨 论

IBS-D是一种常见的以腹泻、腹痛等症状的消化系统疾病。目前，临床上对IBS-D患者的治疗方案主要为5-HT受体拮抗剂、选择性5-HT再摄取抑制剂、解痉剂及止泻药等药物治疗，虽然有一定疗效，但是停药后容易复发，其应用有一定局限性[13-15]。近年来，FMT在调节胃肠道、改善IBS-D症状方面表现出明显的疗效，但其作用机制尚无统一的结论。因此，本研究旨在探讨FMT对IBS-D的治疗效果及作用机制，为临床治疗提供指导。本研究通过构建IBS-D模型大鼠发现，与模型组相比，FMT能够明显改善大鼠精神状态、饮食及腹泻等症状，提示FMT在IBS-D治疗中有明显的疗效。

随着消化系统及神经病理学等基础研究的发展，脑-肠轴学理论越来越受到广泛关注。有研究指出，IBS-D的发病机制主要由中枢神经系统和胃肠道神经系统相互协调，共同调节内脏敏感性和胃肠动力，其中脑肠肽(如5-HT、SP)在起到中间枢纽的作用[16-17]。5-HT是广泛分布于中枢神经系统和胃肠系统中一种常见的脑肠肽，具有多种生理功能，在中枢神经系统中，5-HT的分泌异常能够影响情绪状态，增加不安状态，同时也是作为一种内源性镇痛物质，降低疼痛的敏感性[18]；在胃肠系统中，5-HT参与胃肠道蠕动、炎症分泌等多种功能[19]。5-HT在机体中的合成及与受体间的结合异常会引起胃肠系统和中枢神经系统发生相应的改变[20]。其中，SERT和色氨酸羟化酶1(TPH1)在5-HT的合成及转运过程中起重要作用。SERT是一种广泛分布于胃肠道细胞膜和神经系统中的跨膜转运蛋白，5-HT发挥作用后，会被SERT转运蛋白转运至细胞内失活，进而降低细胞外液中5-HT的浓度[21-22]；而TPH1是一种限速酶，在5-HT合成过程中发挥关键作用，TPH1表达水平升高，会明显升高肠道或中枢神经系统5-HT水平[23-24]。既往有研究指出，胃肠道及中枢神经系统中SERT低表达和TPH1的高表达会明显升高胃肠道或中枢神经系统5-HT水平，从而导致胃肠功能异常及内脏敏感性升高，表现出腹泻、腹痛等不适症状，这可能是诱发IBS-D发病的原因[25]。本研究结果显示，经粪菌移植治疗后，大鼠结肠组织中SERT蛋白表达水平明显升高，而TPH1蛋白表达水平明显降低，且血清5-HT水平明显降低，提示粪菌移植可能是通过抑制TPH1并增强SERT的表达来影响5-HT的合成与摄取，进而调节IBS-D肠道5-HT水平，发挥改善IBS-D大鼠胃肠动力的作用。此外，进一步研究大鼠脑组织相关5-HT信号通路发现，THP1和SERT蛋白的表达趋势与结肠组织一致。究其原因可能在于粪菌移植通过改善胃肠道功能，间接性调控脑组织5-HT信号通路中蛋白的表达，进而改善内脏敏感性及焦虑、抑郁等应激状态。

5-HT发挥生理作用是与其对应的受体结合介导的，其中5-HT3R和5-HT4R与IBS-D关系最为密切。5-HT3R在传递脑-肠轴中胃肠动力和内脏敏感性方面发挥重要作用，5-HT与5-HT3R结合能够升高内脏敏感性，导致IBS-D等胃肠不适状态[26]，而激活5-HT4R受体能够促进乙酰胆碱等物质的释放，从而影响胃肠蠕动及舒张[27]。5-HT3R和5-HT4R表达水平的变化均能影响IBS-D胃肠功能及改变内脏敏感性[28-29]。本研究结果显示，与正常组相比，模型组大鼠中脑组织及结肠组织5-HT3R表达水平明显升高，5-HT4R表达水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，粪菌移植组5-HT3R表达明显降低，5-HT4R的表达明显升高，差异均有统计学意义(P<0.01)。这表明影响5-HT与其受体的结合也是粪菌移植发挥作用的重要机制。

综上所述，5-HT在体内的合成、重摄取，以及与其受体结合受到影响均会导致5-HT信号通路传递异常，进而诱发IBS-D的发生。粪菌移植能够明显改善的IBS-D的不适症状，其机制可能与调控脑-肠轴5-HT信号通路有关。