逆转录聚合酶螺旋反应快速检测蜱传脑炎病毒方法的建立及初步评价*

闫美田，郑雨桐，万 楠

北部战区总医院检验科，辽宁沈阳 110016

蜱传脑炎病毒(TBEV)又名森林脑炎病毒，属于黄病毒科黄病毒属中的烈性病毒，其基因组为单股正链RNA，长约11 kb，经蜱叮咬传播[1-2]，会引发以中枢神经系统病变为主要特征的森林地区自然疫源性疾病[3]，感染者可出现发热、剧烈头痛、神经功能紊乱、外周性弛缓性麻痹等症状，甚至死亡[4-5]，严重威胁人类健康。近年来，军队森林驻扎频繁，林业人员和开发者采伐活动增多，加之森林游、野外游等旅游业的发展，蜱叮咬的概率大大增加，从而增加了TBEV感染的风险。为确保基层和野战现场对TBEV进行早期防控，掌握最佳救治的良机，本研究拟建立逆转录聚合酶螺旋反应(RT-PSR)法，以对TBEV进行现场快速检测。

1 材料与方法

1.1主要试剂 2×EasyTaq PCR SuperMix、pGM-T克隆试剂盒、EasyPure Plasmid MiniPrep Kit、FlyCut SalⅠ、T7 High Efficiency Transcription Kit、EasyPure RNA Purification Kit、EasyPure Blood RNA Kit购自北京全式金生物技术有限公司，SYBR Green Ⅰ、DNase/RNase-Free Water、石蜡油购自北京索莱宝科学技术有限公司，Bst 3.0 DNA聚合酶购自NEB公司，甜菜碱购自Sigma公司。

1.2模板制备 在GeneBank中下载49种TBEV序列，通过BLAST分析选取保守区，发现NS1基因保守性、同源性较高，因此参考TBEV森张株序列(NO.JQ650523)选取NS1基因上的310 bp序列(第2 892～3 201位核酸序列)由安徽通用公司人工合成基因片段，连接到pGM-T载体上(pGM-T克隆试剂盒，北京全式金生物技术有限公司)，并转化到TOP10感受态细胞中，以25%甘油进行菌液储存，提取的质粒经SalⅠ单酶切线性化、纯化后通过体外转录试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)制备RNA标准品。

1.3引物设计 以TBEV森张株序列保守区NS1基因上的310 bp序列为模板，应用Primer 5.0设计一对螺旋引物(Ft/Bt)，该引物由PCR的正、反向引物(F/B)和植物序列(Nr/N)组成，Nr和N序列顺序彼此相反，F和B的Tm值比Nr和N高5 ℃以上，以确保F和B与目的基因结合早于螺旋[5]，引物由通用生物系统(安徽)有限公司合成。RT-PSR 检测TBEV时所用引物序列和Tm值见表1。

表1 RT-PSR 检测TBEV时所用引物序列和Tm值

1.4RT-PSR体系的建立及优化 由于Bst 3.0 DNA聚合酶不是热启动酶，需要在冰上建立反应体系，根据先前实验摸索出的成分及用量建立共25 μL的RT-PSR反应体系：8 U Bst 3.0 DNA聚合酶，2.5 μL的10×Isothermal Amplification Buffer Ⅱ，0.8 mol/L甜菜碱，4 mmol/L MgSO4，1.4 mmol/L dNTPs，Ft、Bt各1.6 μmol/L，RNA模板1.0 μL，最后加DNase/RNase-Free Water补齐到25.0 μL。以TBEV基因组RNA为模板，根据已建立的反应体系进行RT-PSR，以DNase/RNase-Free Water为阴性对照。为了防止气溶胶污染，在反应液上层加入25 μL的石蜡油,接下来在65 ℃恒温金属浴中反应55 min。扩增结果用琼脂糖凝胶电泳进行验证。由于琼脂糖凝胶电泳需要配胶和电泳，操作复杂并且耗时长，为了更满足基层现场的检测条件，本研究通过加1.0 μL 1∶20稀释过的SYBR Green Ⅰ到反应体系中，通过肉眼观察颜色变化来快速判断反应结果。在65 ℃金属浴中反应55 min，对RT-PSR条件进行优化，设置温度梯度为60 ℃、61 ℃、62 ℃、63 ℃、64 ℃、65 ℃，Bst 3.0 DNA聚合酶浓度梯度为2、4、6、8、10、12 U，甜菜碱浓度梯度为0.2、0.5、0.8、1.1、1.4 mol/L,MgSO4浓度梯度为4、6、8、10 mmol/L，dNTPs浓度梯度为1.0、1.4、1.8、2.2 mmol/L，以上条件确定后将反应时间设定为30、35、40、45、50、55、60 min，根据1.5%琼脂糖凝胶电泳条带的亮度和清晰度来选出最佳反应条件。

1.5RT-PSR特异性及灵敏性分析 使用实验室先前合成的融合基因(西尼罗病毒、乙型脑炎病毒、 墨累谷脑炎病毒)和TBEV的RNA标准品在同等条件下应用RT-PSR进行检测，验证该方法的特异性。测定人工合成的TBEV RNA质量浓度为107.341 ng/μL，进行10倍梯度稀释(依次稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8倍)，分别取1 μL进行PCR和RT-PSR扩增，应用1.5%琼脂糖凝胶电泳验证两种方法的检测限，并进行灵敏性比较。

1.6模拟全血标本检测 由于TBEV是烈性病毒，不易收集临床标本，因此选取体检健康的全血标本为模拟标本的基质，加入已知质量浓度的TBEV RNA，制备7个浓度的模拟标本，全血中TBEV RNA的终浓度分别为107.34×10-1、107.34×10-2、107.34×10-3、107.34×10-4、107.34×10-5、107.34×10-6、107.34×10-7ng/μL，以纯全血标本作为阴性对照。按照EasyPure Blood RNA Kit说明书进行RNA提取。

2 结 果

2.1RT-PSR体系的建立及优化 琼脂糖凝胶电泳结果显示，TBEV基因组出现明显的梯状条带，阴性对照无条带，TBEV基因组的SYBR Green Ⅰ由橙色变为绿色，阴性组保持橙色不变，并且在紫外灯下TBEV基因组可见绿色荧光，阴性组无荧光。结果表明，SYBR Green Ⅰ可作为RT-PSR的指示剂(图1)，验证了建立的RT-PSR反应体系的可行性。在60～65 ℃条件下，61 ℃条带最亮、最清晰；在同等温度条件下分别加入2～12 U Bst 3.0 DNA聚合酶，结果显示，6 U的Bst 3.0 DNA聚合酶条带最亮、最清晰；分别加入0.2～1.3 mol/L的甜菜碱，结果显示0.5 mol/L浓度的甜菜碱结果最理想；4、6、8、10 mmol/L浓度梯度的MgSO4中，结果显示8 mmol/L的结果最理想；确定dNTPs的浓度为1.8 mmol/L;在不同时间范围内进行反应(30～60 min),最终确定反应时间为55 min时最理想(图2)。

注：A为 1.5%琼脂糖凝胶电泳结果，M为5 000 DNA标记物，1为TBEV的RNA标准品，N为阴性对照(DNase/RNase-Free Water)；B为 SYBR Green Ⅰ在自然光下扩增产物的显色结果；C为SYBR Green Ⅰ在紫外光下扩增产物的显色结果；B、C中1、2为TBEV的RNA标准品，3、4为阴性对照(DNase/RNase-Free Water)。

注：A为优化RT-PSR扩增的温度；B为优化Bst 3.0 DNA聚合酶的浓度；C为优化甜菜碱的浓度；D为优化MgSO4浓度；E为优化dNTPs的浓度；F为优化RT-PSR的反应时间；M为5 000 DNA标记物；N为阴性对照(DNase/RNase-Free Water)。

2.2RT-PSR特异性及灵敏性分析 电泳结果显示，含有TBEV的RNA标准品才呈现标准的梯形条带，而西尼罗病毒、乙型脑炎病毒、墨累谷脑炎病毒的融合基因和阴性对照没有明显条带,有TBEV的RNA标准品在自然光下SYBR Green Ⅰ由橙色变为绿色，而融合基因和阴性对照在自然光下SYBR Green Ⅰ仍为橙色，只有TBEV的RNA标准品在紫外光下发出绿色荧光，结果表明，RT-PSR可特异检测出TBEV(图3)。已稀释的模板分别进行PCR和RT-PSR，电泳结果显示，PCR在107.34 ng/μL稀释10-1、10-2、10-3、10-4倍时有条带，当质量浓度低于107.34×10-4ng/μL时无明显条带，RT-PSR在107.34 ng/μL稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍时有条带，当质量浓度低于107.34×10-6ng/μL时无明显条带，指示剂在自然光和紫外光下显色结果与电泳结果相同，可见RT-PSR最低检测限是PCR的100倍，见图4。

注：A为1.5%琼脂糖凝胶电泳结果；B为自然光下SYBR GreenⅠ的RT-PSR反应结果；C为紫外光下SYBR Green Ⅰ的RT-PSR结果；M为5 000 DNA标记物，1为TBEV RNA，2为融合基因(西尼罗河病毒、日本脑炎病毒、墨累谷脑炎病毒)；N为阴性对照(DNase/RNase-Free Water)。

注：A、B为1.5%琼脂糖凝胶电泳结果；C为自然光下SYBR Green Ⅰ的RT-PSR结果；D为紫外光下SYBR Green Ⅰ的RT-PSR结果；M为5 000 DNA标记物，1～8 TBEV RNA质量浓度分别为107.34×10-1、107.34×10-2、107.34×10-3、107.34×10-4、107.34×10-5、107.34×10-6 、107.34×10-7 、107.34×10-8 ng/μL，N为阴性对照(DNase/RNase-Free Water)。

2.3模拟全血标本 RT-PSR检测7种不同浓度的TBEV模拟全血标本，结果表明符合率为100%，见图5。最低检测限为107.341×10-5ng/μL，灵敏性比RNA标准品低10倍。

注:A为1.5%琼脂糖凝胶电泳结果；B为自然光下SYBR Green Ⅰ的RT-PSR结果；C为紫外光下SYBR Green Ⅰ的RT-PSR结果；M为5 000 DNA标记物；1～7为质量浓度分别为107.34×10-1、107.34×10-2、107.34×10-3、107.34×10-4、107.34×10-5、107.34×10-6 、107.34×10-7 ng/μL 的TBEV模拟全血标本；N为阴性对照(体检健康者的纯全血标本)。

3 讨 论

聚合酶螺旋反应(PSR)是2015年LIU等[6]团队发明的一种新的等温核酸扩增方法，利用Bst DNA聚合酶的链置换功能、热稳定性及DNA聚合酶活性，以及甜菜碱解开DNA双链的作用进行检测，该方法只需要一对引物(Ft/Bt)，即在PCR的正、反向引物的5′端加上植物序列Nr/N，并且Nr和N序列彼此相反，从而实现反复的引物延伸(①→②、③→④)、解链(②→③、④→⑤)、置换(⑤)、卷曲(⑥)，接下来卷曲结构的3′端继续向前延伸(⑦)，最终通过自螺旋方式(⑧)大量扩增(图6)，从而实现简单快速、高灵敏性和特异性检测。

目前,已有研究人员应用PSR方法进行细菌、真菌及病毒的检测[7-11]，而先前适当研究对RNA病毒检测时需要在反应前进行逆转录或者是在反应体系内加入逆转录酶等才能实现PSR扩增，本研究建立的RT-PSR仅需一种酶，即Bst 3.0 DNA聚合酶，它不仅具有链置换活性，还具有耐高温逆转录酶活性，在等温条件下一种酶可同时实现逆转录和核酸扩增。此外，PSR反应体系中加入颜色指示剂，可以通过阴阳性反应的颜色差异现场快速判断实验结果。

注：①→②、③→④为引物延伸，②→③、④→⑤为解链，⑤为置换，⑥为卷曲，⑦为延伸，⑧为通过自螺旋方式扩增。

TBEV分为3个亚型，欧洲型TBEV(TBEV-Eu)、西伯利亚型TBEV(TBEV-Sib)和远东型TBEV(TBEV-FE)[4,12]，我国流行的主要是TBEV-FE，流行主要地区有吉林、黑龙江和内蒙古地区，新疆和云南也有病例出现[13]。目前TBEV感染的检测方法有血清学方法及核酸检测方法，但是血清学方法要求待检验品的抗原、抗体含量高，而且检测灵敏度较低，易出现“窗口期”导致漏检；核酸检测方法主要是PCR，需要反复变温循环和元件精密的复杂仪器，时间成本和经济成本较高，核酸检测领域还有分子杂交等技术，但成本高昂、操作烦琐。本研究建立RT-PSR在恒温条件下只需一对特异性引物就可实现核酸大量扩增，具有高特异性、高灵敏性、节约时间和成本等优点，可实现基层现场对TBEV的精准检测，能够对TBEV进行早期防控，对感染者进行早期治疗，避免后遗症,甚至死亡的发生。

本研究根据RT-PSR方法的原理，以TBEV NS1基因序列设计一对引物Ft/Bt,对反应条件及主要成分采用单因素变化法进行优化，最终确定的反应条件为在25.0 μL的反应体系中：6 U的Bst 3.0 DNA聚合酶，0.5 mol/L的甜菜碱，8 mmol/L的MgSO4，1.8 mmol/L的dNTPs，1.0 μL的RNA模板，Ft、Bt各1.0 μL，加入无菌无酶水补齐25.0 μL，61 ℃恒温金属浴中反应55 min。SYBR Green Ⅰ 能与双链DNA结合，由橙色变为绿色，紫外光下会发出荧光，但SYBR Green Ⅰ 会抑制PSR反应，因此需要反应结束后开盖加入[14]。

当前的核酸扩增方法对于RNA需要事先进行逆转录,而RT-PSR检测方法最佳反应温度61 ℃，逆转录酶的活性为30～68 ℃，正好包括了RT-PSR的最佳反应温度,因此可以逆转录和扩增同时进行；当前的核酸扩增方法要么需要95 ℃初始变性，要么需要加入DNA解旋酶，而RT-PSR检测方法只需加入甜菜碱，当达到反应温度时，便可以使DNA双链解开，达到单双链的动态平衡。

由于TBEV是烈性病毒，不易收集标本，因此本研究制备了7种不同浓度模拟全血标本，用RT-PSR进行检测，将检测结果与加入RNA标准品进行对比，评价该方法检测实际全血感染标本的能力。本研究结果表明，用该RT-PSR检测模拟标本的符合率可达到100%，最低检出浓度为107.341×10-7ng/μL，提示RT-PSR检测方法可以对全血标本中微量的TBEV进行准确检测。

综上所述，RT-PSR检测方法对TBEV具有良好的特异性和灵敏性，检测限是PCR的100倍。此外，该方法所用仪器简单、成本低(水浴锅或者恒温金属浴)，只需要一种酶，通过观察指示剂的颜色变化即可判断结果，操作简便，反应稳定性高，实现了现场快速检测，有助于基层对TBEV的早期诊断。