聚天冬氨酸凝胶的制备及生物降解性

岳瑶，蒲梦凡，王文瑞，赵俭波，，曹辉

（1 塔里木大学新疆兵团南疆化工资源利用工程实验室，新疆阿拉尔 843300；2 北京化工大学北京市生物加工过程重点实验室，北京 100029）

聚天冬氨酸（polyaspartic acid，PASP）由单体天冬氨酸通过肽键相互链接而成，其侧基带有大量未反应的羧基，具有良好的反应性。北京化工大学国家能源生物炼制中心以乙二醇二缩水甘油醚（EGDE）为交联剂，将PASP 分子链相互链接可以得到微观结构呈空间网络状的PASP凝胶。PASP凝胶能够吸收大量去离子水，与土壤混合具有减少水层蒸发渗漏、提高土壤的保水性以及改良土壤结构等作用，常用作农林保水剂，除此之外，PASP 凝胶在生物医药、生态修复、碳材料等领域均有应用潜力。

PASP 凝胶由于具有类似蛋白质的多肽主链结构，易受到霉菌、细菌等微生物侵袭降解为低分子肽、氨基酸、NH、CO和HO等，其降解受自身结构影响。当前，以乙二醇二缩水甘油醚为交联剂制备的PASP 凝胶存在降解速率过快、难以与农作物生长周期相适应的问题，尽管提高交联度可以延迟降解，但会抑制凝胶的吸水保水性，因此控制PASP 凝胶的降解速率且保证较高的吸水率，使之与作物生长周期相匹配是当前研究工作的重点。

丙三醇三缩水甘油醚（GTE）与乙二醇二缩水甘油醚结构相似，均属于环氧化合物（图1），由图1可以看出，GTE带有三个环氧基团，可在较低交联度下形成更致密网络结构。本文拟通过控制GTE 用量制备不同交联度的PASP 凝胶，考察其生物降解性，探究交联度对降解性的影响，并与以EGDE交联PASP凝胶进行对比。

图1 环氧类交联剂的结构

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

（1）试剂 聚琥珀酰亚胺（PSI），环渤海生物产业研究院提供，分子量(1～2)×10，纯度98%；EGDE 与GET 均由常州润天远新材料有限公司提供；磷酸、NaOH、(NH)SO、KHPO、KHPO、NaCl、FeSO·7HO、MgSO·7HO，琼脂等均为分析纯。

（2） 仪器 SHJ-6A 恒温测速磁力搅拌器；ST170 磁力搅拌水浴锅；PHSJ-3F 便携式pH 计；S·SW-CJ-2F超净台；THZ-98AB恒温摇床；XFH-40CA 高温灭菌锅； KM-330 恒温培养箱；Multiskan Sky 微孔板酶标仪；HH-6 型COD 测定仪；Nicolet iS10 傅里叶红外光谱仪；SU8020 场发射扫描电子显微镜；AR2000ex 旋转流变仪；TA449F3热重分析仪。

1.2 实验

1.2.1 丙三醇三缩水甘油醚交联聚天冬氨酸凝胶的制备

GTE 交联PASP 凝胶制备方法与EGDE 交联PASP 凝胶相似，具体方法如下：准确称取6g PSI 溶于36mL 浓度为2mol/L 的氢氧化钠溶液中，在磁力搅拌器上搅拌1～2h，待PSI完全溶解后，用85%磷酸调节pH 至4.8 左右，然后加入一定量的GTE，置于50℃磁力搅拌水浴锅中反应12h即可制得凝胶。将PASP 凝胶剪碎后置于60℃鼓风干燥箱中干燥24h，研磨过60目筛，备用。

本文制备了两种交联度分别为40%、50%、60%的凝胶，交联度的计算如式(1)。

式中，为交联剂的质量，g；为交联剂的相对分子质量；为聚琥珀亚酰胺（PSI）的质量，g；为琥珀亚酰胺环的相对分子质量；为交联剂中环氧基团的个数。

1.2.2 PASP凝胶表征

采用FTIR对PASP凝胶进行表征，将样品交替用水和无水乙醇浸泡洗涤，烘干，研磨，KBr压片后置于仪器中测定；采用SEM观察PASP凝胶的表面形貌，将处理后样品导电胶固定，喷金后观察；采用热重分析仪分析PASP 凝胶的热性能，N保护，升温速率5℃/min；采用旋转流变仪监测凝胶的弹性模量和损耗模量，保持1%的恒定应变和1 rad/s的频率。

1.2.3 PASP凝胶吸水性测定

PASP 凝胶的吸水性能可通过茶袋法测定。分别称取0.1g 不同交联度的PASP 凝胶粉末置于茶袋中，将袋口系紧后浸入盛有蒸馏水的烧杯中保持悬挂状态，且袋口应避免浸入蒸馏水中。常温下吸水一段时间后取出静置，控干水分后称重，并及时补充烧杯中的水。吸水率的计算如式(2)。

式中，为水凝胶的溶胀率，%；为吸水后凝胶的质量，g；为PASP凝胶的质量，g。

1.2.4 PASP凝胶的生物降解性

以被测样品作为唯一碳源和能源，所接种的细菌和放线菌菌种由塔里木大学新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室提供，由本地土壤中分离培养得到。采用平板培养法观察细菌和放线菌在平板上的生长情况。

采用液体培养法评价材料的生物降解性。通过测量液体培养基的值和COD值评价PASP凝胶的降解性。采用滴定法分别在第1 天、第3 天、第5 天、第7 天、第9 天测量发酵液的COD 值，平行测定三次，凝胶降解率计算如式(3)。

式中，COD为初始发酵液的化学需氧量，mg/L；COD第天发酵液的化学需氧量，mg/L。

2 结果与讨论

2.1 PASP凝胶的表征

2.1.1 FTIR分析

采用FTIR 分析PSI、EGDE 交联PASP 凝胶和GTE 交联PASP 凝胶的官能团，结果如图2 所示。由图2 可以看出，PSI 在3600cm处是游离的O—H键的吸收峰，在2950cm处是—CH—的吸收峰，1712cm处是琥珀酰亚胺五元环结构的吸收峰，1400cm处是酰胺键里C—N键的伸缩振动峰，可以看出与PASP 相比，这几个峰均出现了明显减弱甚至消失。GTE 为交联剂制备的PASP 凝胶与以EGDE为交联剂制备的PASP凝胶红外谱图极相似，都存在3200cm处的羧基的O—H 键吸收峰，600cm处C==O 双键的吸收峰，1392cm处C—N的伸缩振动峰，1050cm处的C—O—C 键吸收峰，说明可以采用丙三醇三缩水甘油醚为交联剂制备PASP凝胶。

图2 PSI、EGDE交联PASP凝胶、GTE交联PASP凝胶红外吸收光谱

2.1.2 SEM分析

采用SEM 观察EGDE 交联PASP 凝胶和GTE 交联PASP凝胶的表面形貌，结果如图3所示。由图3(a)可以看出，EGDE 为交联剂制备的PASP 凝胶表面疏松粗糙，且存在大量的孔洞结构，孔径较大，有利于水分子进入。由图3(b)可以看出，以GTE为交联剂制备的PASP 凝胶表面较光滑，有一定程度褶皱和少量孔。

图3 以EGDE、GTE为交联剂的PASP凝胶SEM图

2.1.3 热性能分析

采用TG-DTG分析交联度为50%的EGDE交联PASP凝胶和GTE交联PASP凝胶的热性能。

由图4(a)可知，以EGDE为交联剂制备的PASP凝胶在250℃左右质量分数下降到85%，而以GTE为交联剂的凝胶在300℃左右质量分数下降至85%；以EGDE为交联剂的PASP凝胶在430℃左右质量分数下降到18%，而以GTE 为交联剂的凝胶在470℃左右质量分数下降至28%，之后质量分数基本保持不变，PASP凝胶结构完全断裂，转变为碳材料。

图4 PASP凝胶的TG、DTG图

由图4(b)可知，以EGDE为交联剂制备的PASP凝胶在温度为250℃左右有一个尖锐峰，在此处发生了水分子丢失、大量的长链断裂变成短链，网状结构被破坏降解为二氧化碳等小分子，质量分数急剧下降。以GTE 为交联剂制备的PASP 凝胶在温度270℃左右出现了一个较宽峰，但峰高约为0.4，可能是水分子逸出导致，在温度380～410℃又出现了一个较宽的双头峰，峰高可达到0.5 左右，主要是PASP 凝胶的网状结构被破坏，并且破坏的速率较慢，质量分数没有发生急剧地上升和下降。综上所述，以GTE为交联剂的PASP凝胶耐热性更优。

2.1.4 黏弹性能分析

采用旋转流变仪测定交联度为50%的EGDE交联PASP 凝胶和GTE 交联PASP 凝胶的弹性模量和损耗模量。

图5为PASP凝胶的黏弹性能曲线。如图5(a)所示，角频率为50rad/s时，GTE交联的凝胶比EGDE交联的凝胶的弹性模量'高出约1750Pa，说明GTE 交联凝胶有更高的强度。且GTE 交联的凝胶比EGDE 交联的凝胶损耗模量低[图5(b)]，说明GTE交联的凝胶在相同的形变条件下损耗的能量更少。对比GTE 交联的凝胶的弹性模量'和损耗模量可以发现其弹性模量远远大于损耗模量，说明在外力的作用下主要发生了弹性形变，产生的损耗较少，更加充分证明GTE交联PASP凝胶更致密的网状结构，材料的韧性显著增强。

图5 PASP凝胶的黏弹性能

2.2 PASP凝胶的吸水性能分析

采用茶袋法分别测定EGDE 和GTE 交联PASP凝胶不同交联度下的吸水率，试验结果如图6 所示。由图6可以看出，以EGDE 为交联剂交联度为40%的PASP 凝胶吸水率最高，72h 时吸水率达193g/g，主要是由于交联度较低时，PASP 凝胶网络结构较为稀疏，易于水分子的吸附与扩散，增大交联度，PASP 凝胶的吸水率降低；以GTE 为交联剂交联的PASP 凝胶也具有相似规律，交联度为40%时，其最大吸水率为178g/g，低于相同交联度下EGDE 交联的PASP 凝胶，主要是由于交联剂分子官能度更大，在相同交联度下分子结构更为紧密，水分子的渗透与扩散更为困难。

图6 EGDE与GTE交联PASP凝胶不同交联度下的吸水率曲线

2.3 PASP凝胶生物降解性分析

2.3.1 平板培养法

采用放线菌分别接种EGDE 交联不同交联度PASP 凝胶和GTE 交联不同交联度PASP 凝胶，平板培养10天后的照片如图7所示。

图7 放线菌接种EGDE交联不同交联度PASP凝胶和GTE交联不同交联度PASP凝胶照片

从图7 可以看出，放线菌在平板上生长明显，EGDE交联PASP凝胶和GTE交联PASP凝胶均可被降解，降解程度与交联度并不明显。

采用细菌分别接种EGDE 交联不同交联度PASP 凝胶和GTE 交联不同交联度PASP 凝胶，平板培养10 天后的照片如图8 所示。从图8 可以看出，EGDE交联PASP凝胶和GTE交联PASP凝胶均具有良好的生物降解性，且细菌在EGDE 交联PASP 凝胶中生长更为明显，出现了较大的菌体，菌体量与交联度有直接关系，这说明交联度较低时，PASP 凝胶更易于降解，降解产物能给细菌提供C、N等营养物质，细菌生长速率加快，菌体量增多。

图8 细菌接种EGDE交联不同交联度PASP凝胶和GTE交联不同交联度PASP凝胶照片

2.3.2 液体培养法

在平板培养法中可以看出，细菌对PASP 凝胶的降解影响更明显，以交联PASP 为唯一碳源和氮源，接种细菌菌液，恒温摇床上发酵，测定发酵液的COD值，计算降解率，其结果如图9所示。

PASP 凝胶降解后有大量短多肽链及小分子氨基酸等生成，有机质含量增大，COD值增大。从图9(a)可以看出，在液体培养过程中，以GTE为交联剂的交联度为40%的PASP 凝胶的第9 天降解率为59.8%，交联度为60%的PASP 凝胶的降解率为49.3%，降低17.5%，交联度越小，降解速率越快。如图9(b)可知，以EGDE 为交联剂交联度为60%的PASP凝胶第9天的降解率为54.3%，比以GTE为交联剂交联度为60%的PASP 凝胶的降解率高9.2%，相同交联度下GTE 交联PASP 凝胶网络结构更致密，降解越慢。

图9 液体培养法中同一交联剂不同交联度、同一交联度不同交联剂PASP凝胶的降解率曲线

是利用吸光度来测量细菌培养液的浓度，从而估计细菌的生长情况。考察了不同交联剂及交联度的PASP凝胶在发酵液中的值的变化，结果如图10所示。由图10(a)可知，在液体培养法中，以GTE 为交联剂交联度为40%的PASP 凝胶9h 的值为1.72，交联度为60%时凝胶的值为1.2，菌体量明显降低，降解度下降。由图10(b)可以看出，以EGDE 为交联剂交联度为60%的PASP凝胶在9h时的值为1.4，比相同交联度下GTE交联的PASP 凝胶高14.2%，说明GTE 交联的PASP凝胶降解速率更慢。

图10 液体培养法中同一交联剂不同交联度、同一交联度不同交联剂PASP凝胶的OD600曲线

3 结论

聚天冬氨酸凝胶作为一种新型环境友好型高分子材料，在农林保水、水处理、环境保护、生物医药、化妆品等诸多领域都有极大的应用潜力。本文采用GTE 为交联剂制备PASP 凝胶，并与EGDE 交联PASP 凝胶进行了对比，最后考察凝胶的生物降解性。结果表明：与EGDE 交联PASP 凝胶相比，GTE 交联凝胶吸水率较低，交联度为40%时，吸水率为178g/g，具有良好的吸水保水性，而且耐热性和黏弹性更优，平板培养证明GTE交联PASP凝胶也可被放线菌、细菌等微生物降解，液体培养法证明交联剂种类和交联度对凝胶的降解速率均有显著影响，交联度均为60%时，GTE 为交联剂的凝胶第9 天降解率为49.3%，较EGDE 为交联剂的凝胶低9.2%，相同交联度下GTE 交联凝胶网络结构更致密，降解更慢；以GTE 为交联剂时，交联度为40%的凝胶第9 天降解率为59.8%，较交联度为60%的凝胶提高了17.5%，交联度越低，降解速率越快，通过测试发酵液中的值也显示相同的趋势。一般而言，PASP 凝胶越易形成致密网络就越不利于水分子的渗透和扩散，但材料的强度、韧性及耐久性均会增强，