不同红豆杉属植物中7种紫杉烷类化合物的HPLC检测与分析

崔海超, 郑文艺，张智慧，傅岳峰，李欣悦，付玉杰,2，顾成波*

(1.东北林业大学 森林植物生态学教育部重点实验室, 林业生物制剂教育部工程研究中心，黑龙江省林源活性物质生态利用重点实验室， 哈尔滨 150040； 2.北京林业大学 林学院，北京 100083)

0 引言

红豆杉属植物为常绿乔木或灌木，全世界有11种。我国有4种和1个变种，分别是中国红豆杉(Taxuschinensis)、云南红豆杉(Taxusyunnanensis)、西藏红豆杉(Taxuswallichiana)、东北红豆杉(Taxuscuspidata)、南方红豆杉(Taxuschinensisvar.mairei)(变种)。此外，还有引种我国的杂交品种曼地亚红豆杉(Taxus×mediacv.hicksii)，其母本为东北红豆杉，父本为欧洲红豆杉(Taxusbaccata)[1]。

红豆杉是我国的一级珍稀濒危保护树种，含有多种药用成分。红豆杉叶可以入药，具有治疗痛经、利尿的功效，主治肾炎浮肿、小便不利和糖尿病等症。紫杉醇(Paclitaxel)是从红豆杉科红豆杉属植物中分离得到的一种四环二萜类生物碱，自1992 年美国FDA批准上市以来，已成为世界上公认的抗癌用药[2]。

紫杉烷类化合物是与紫杉醇合成代谢相关的二萜类化合物的总称，目前从红豆杉属植物中分离出的紫杉烷类化合物已有500余种[3]。除了紫杉醇，三尖杉宁碱(Taxol B)、巴卡亭Ⅲ(Baccatin Ⅲ)、10-去乙酰基巴卡亭(10-DAB)、10-去乙酰基紫杉醇(10-DAT)、7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇(7-xyl-10-DAT)和7-表-10-去乙酰基紫杉醇(7-epi-10-DAT)也均是紫杉烷化合物。由于一些紫杉烷类化合物与紫杉醇的结构相似，可作为紫杉烷类药物的半合成原料，通过结构修饰改造成紫杉醇，甚至药效更好的化合物，在抗癌药物合成中具有重要应用[4-5]。

红豆杉属植物中紫杉烷类成分含量极低，同时分析检测多种红豆杉中紫杉烷类化合物较困难。红豆杉不同品种、不同年龄，甚至同一品种的不同提取部位，紫杉烷类化合物的含量均有明显的差异[6-8]。为分析比较不同红豆杉属植物中紫杉烷类物质含量的差异，本研究以3种红豆杉属植物(东北红豆杉、南方红豆杉和曼地亚红豆杉)为研究对象，在建立7种紫杉烷类化合物(紫杉醇、10-去乙酰基巴卡亭、三尖杉宁碱、巴卡亭Ⅲ、10-去乙酰基紫杉醇、7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇和7-表-10-去乙酰基紫杉醇)的高效液相色谱(HPLC)检测方法的基础上，对3种红豆属植物中紫杉烷类化合物含量进行了比较分析[9-13]，旨在为红豆杉属植物的质量控制、种源选育、资源的保护与合理开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

东北红豆杉、南方红豆杉和曼地亚红豆杉主干树皮样品，来源于东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室科研温室内7年生盆栽苗。

标准品紫杉醇、三尖杉宁碱、巴卡亭Ⅲ、10-去乙酰基紫杉醇、10-去乙酰基巴卡亭、7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇和7-表-10-去乙酰基紫杉醇对照品(四川省维克奇生物科技有限公司)，纯度均大于98%。色谱级乙腈大于等于99.9%(迪马科技有限公司)，色谱级甲醇大于等于99.9%(迪马科技有限公司)，分析纯甲醇大于等于99.5%(天津市天力化学试剂有限公司)；水为超纯水。

1.2 仪器

Agilent Technologies 1290 infinityⅡ高效液相色谱(美国Agilent公司)，HiQsil C18色谱柱(日本KYATECH公司)，1290VWD紫外吸收检测器(美国Agilent公司)； AB104型电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ-250DB型数控超声机(昆山市超声仪器有限公司)；RFA-02L型旋转蒸发仪(上海青浦沪西仪器厂)。

1.3 色谱条件

色谱柱为 HiQsil C18(250 mm × 4.6 mm, 5 μm)，考察了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-1%体积分数乙酸水溶液和乙腈-1%体积分数乙酸水溶液4种不同流动相体系及4种不同检测波长(227、250、273、228 nm)下各紫杉烷类成分的色谱行为。根据基线分离效果，采用乙腈-水作为流动相；梯度洗脱程序为：0～10 min，30%乙腈；10～12 min，30%～45%乙腈；12～25 min，45%乙腈；25～30 min，42%～45%乙腈；30～40 min，30%～42%乙腈；流速为1 mL/min；检测波长为227 nm(筛选了4种检测波长，最终确定227nm为最佳检测波长)；柱温为30 ℃；进样量为10 μL。

1.4 对照品溶液制备

分别称取7种紫杉烷类化合物的标准品10 mg，添加质量分数100%色谱级甲醇溶液溶解并将其定容到10 mL的容量瓶中，使样品溶液均成质量浓度为1 mg/mL的标准贮备液。使用0.22 μm微孔滤膜过滤，置入-20 ℃待用。

1.5 供试品溶液的制备

参考文献[10]的方法并稍做改动，将东北红豆杉、南方红豆杉和曼地亚红豆杉主干树皮洗净，于60 ℃干燥后粉碎样品。每种红豆杉样品取粉末1.0 g于50 mL的锥形瓶中，加入30 mL 80%乙醇，超声提取30 min，过滤，重复此操作2次，收集3次样品溶液滤液，合并3次滤液。滤液经过浓缩后加入甲醇溶液溶解定容到一定体积，分离液加入等量等比例脱脂溶液(乙酸乙酯)脱脂，放置过夜，对其离心去上清液，用0.22 μm微孔滤膜过滤，得到3份不同红豆杉属植物制得的样品，各取2 mL不同样品混合均匀，之后进行紫杉烷类化合物的检测。

1.6 线性关系及精密度、重现性试验

取7种紫杉烷类化合物的混合对照品溶液，使用100%甲醇逐级稀释，按1.3确定的色谱条件检测，根据上述的对照品质量浓度及测定的峰面积分别绘制出各紫杉烷类化合物的标准曲线，每条标准曲线由6个不同质量浓度组成，峰面积为3次重复进样测得的平均值。

取7种混合对照品溶液，按1.3确定的色谱条件，分别将同一对照品溶液重复测定6次，分析每次测定的对照品的保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)，考察检测方法的精密度。

取同一批3种红豆杉树皮适量，每批平行制备6份供试溶液，在设定的液相色谱条件下进样，测定其中所含7种紫杉烷类化合物的含量，对紫杉烷类化合物的含量进行比较，考察试验方法的重现性。

1.7 加样回收率试验

取14份配制好的东北红豆杉样品溶液，分别加入对照品，2种标准品质量不同，在所设定的色谱条件下进样测定，计算加样回收率。

加样回收率计算公式为

(1)

式中：C1为所测功能成分总量；C2为样品中功能成分质量；M为加入标准品后功能成分质量。

1.8 数据处理

应用 Excel 进行数据整理和绘图，用 SPSS 22.0进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 HPLC检测结果分析

2.1.1 不同高效液相色谱条件下检测结果

已有研究中对紫杉烷的检测方法较多[11-14]，但多限于3～5种物质的同时检测，且基线分离效果差，由于紫杉烷类化合物具有相近的极性和化学结构，导致同时分析多组分紫杉烷类成分难度较大[15-17]。为了使7种紫杉烷类化合物完全分离、色谱图基线平稳，本研究考察了7种紫杉烷类化合物在228、250、273、227 nm 波长下的出峰情况，以及4种不同流动相(乙酸-甲醇、乙酸-乙腈、水-甲醇和水-乙腈)体系对各紫杉烷类化合物色谱出峰行为的影响[18-19]，图1为不同波长下检测的出峰情况。最终确定为分离条件为乙腈-水，梯度洗脱(0～10 min，30%乙腈；10～12 min，30%～45%乙腈；12～25 min，45%乙腈；25～30 min，42%～45%乙腈；30～40 min，30%～42%乙腈)；紫外检测波长为227 nm。液相分析方法的建立主要考察流动相体系、检测波长、流动相比例；本实验分别采用4种流动相体系及4种检测波长，根据7种紫杉烷类化合物的基线分离效果对流动相体系和检测波长进行优化，确定最佳流动相和检测波长。流动相比例是采用梯度洗脱，逐级摸索流动相的比例确定，在液相方法的建立中通常给定最佳条件即可，因为是梯度洗脱，流动相比例是逐级改变的。

1.10-去乙酰基巴卡亭，2.巴卡亭Ⅲ，3.7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇，4.10-去乙酰基紫杉醇，5.三尖杉宁碱，6.7-表-10-去乙酰基紫杉醇，7.紫杉醇

图2为在检测波长227 nm、流动相为水-乙腈优化条件下各紫杉烷标准品与样品色谱图，7种紫杉烷类化合物出峰顺序为：10-去乙酰基巴卡亭、巴卡亭Ⅲ、7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇、10-去乙酰基紫杉醇、三尖杉宁碱、7-表-10-去乙酰基紫杉醇、紫杉醇。

1.10-去乙酰基巴卡亭,2.巴卡亭Ⅲ,3.7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇,4.10-去乙酰基紫杉醇,5.三尖杉宁碱,6.7-表-10-去乙酰基紫杉醇,7.紫杉醇

2.1.2 线性回归分析

吸取对照品溶液2 mL，使用质量分数100%甲醇依次进行2倍稀释，在所设定的色谱条件下测定各紫杉烷类化合物含量。以各成分质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，结果见表1。结果表明，7种紫杉烷类化合物在所测定的线性范围内均具有良好的线性关系，决定系数均在0.995 2以上。

表1 各紫杉烷类化合物各成分线性回归结果

2.1.3 精密度和重现性分析

精密度试验取对照品溶液，在所设定的色谱条件下进行6次测定。精密度试验结果显示，在本试验检测条件下，10-去乙酰基巴卡亭、巴卡亭Ⅲ、7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇、10-去乙酰基紫杉醇、三尖杉宁碱、7-表-10-去乙酰基紫杉醇和紫杉醇的色谱峰出峰时间相对标准偏差(RSD)分别为0.94%、0.33%、0.49%、0.64%、1.09%、1.59%、2.33%，表明仪器精密度良好。

取同一批3种红豆杉树皮适量，每批平行制备6份供试溶液，在所设定的色谱条件下进行重复性试验。结果表明，色谱峰面积RSD分别为2.14%、2.82%、3.14%、1.27%、2.38%、3.22%、3.79%，说明方法的重现性良好。

重复性试验结果显示，东北红豆杉样品中10-去乙酰基巴卡亭、巴卡亭Ⅲ、7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇、10-去乙酰基紫杉醇、三尖杉宁碱、7-表-10-去乙酰基紫杉醇和紫杉醇含量平均值分别为0.376、0.395 、0.266 、0.157 、0.092 、0.053 、0.234 mg/g，RSD值为1.74%、1.25%、1.20%、1.39%、1.09%、1.55%、1.58%，表明该方法重复性良好。

2.1.4 加样回收率

对不同添加量下7种紫杉烷类化合物的加样回收率进行分析，结果见表2。由表2可得巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰基紫杉醇的平均加样回收率最高，分别为107.43%和104.88%，其中在样品添加量为5 μg的时候效果最好，回收率分别为109.27%和108.31%。10-去乙酰基巴卡亭、巴卡亭Ⅲ、7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇、10-去乙酰基紫杉醇、三尖杉宁碱、7-表-10-去乙酰基紫杉醇和紫杉醇的平均回收率分别为94.62%、107.43%、96.28%、104.88%、96.23%、95.41%和95.96%，相对标准偏差(RSD)值分别为1.43%、2.09%、1.06%、2.23%、1.52%、1.43%和1.4%，均小于4%，表明1.3所确定的检测方法回收率较好。

表2 7种紫杉烷类化合物加样回收率试验结果(n=5)

2.2 红豆杉属中7种紫杉烷类化合物含量分析与对比

影响红豆杉植株中紫杉烷类物质积累的因素十分复杂，不同品种、年限等因素均对其成分产生影响[6]。盆栽7年生3种红豆杉属植物(东北红豆杉、南方红豆杉和曼地亚红豆杉)主干树皮中7种紫杉烷类化合物含量测定结果见表3。

表3 不同品种红豆杉中各紫杉烷类成分含量 (n = 5) Tab.3 Taxanes contents in different Taxus species (n = 5) mg·g-1

东北红豆杉、南方红豆杉、曼地亚红豆杉树皮中紫杉醇含量分别为0.234、0.043、0.167 mg/g，三尖杉宁碱含量分别为0.092、0.034、0.053 mg/g，10-去乙酰基巴卡亭含量分别为0.376、0.158、0.063 mg/g，10-去乙酰基紫杉醇含量分别为0.157、0.113、0.126 mg/g，巴卡亭Ⅲ含量分别为0.395、0.116、0.074 mg/g，7-表-10-去乙酰基紫杉醇含量分别为0.053、0.027、0.033 mg/g，7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇含量分别为0.266、0.564、0.315 mg/g。

因植物活性成分含量往往受地域、土壤、气候、树龄和品种等多种因素影响，为准确比较不同红豆杉品种中紫杉烷类成分含量差异，本研究采用温室控制条件下培育的不同品种红豆杉为实验材料，重点考虑品种因素对植物活性成分含量的影响，避免了其他因素对实验结果的干扰。本研究所建立的检测方法，不仅适用于温室盆栽或林地红豆杉样品分析，也适用于其他生物样品(动物/人体血液、组织等)中紫杉烷类化合物的含量检测，是一种广谱性的高通量紫杉烷类化合物分析检测方法。

不同种红豆杉紫杉烷类化合物含量差异较大，紫杉醇和三尖杉宁碱含量以东北红豆杉最高，其次是曼地亚红豆杉，二者含量远高于南方红豆杉。10-去乙酰基巴卡亭和巴卡亭Ⅲ的含量曼地亚红豆杉最低，东北红豆杉中最高，其中10-去乙酰基巴卡亭在曼地亚红豆杉中的含量不足其他2种红豆杉的一半。10-去乙酰基紫杉醇和7-表-10-去乙酰基紫杉醇的含量在3种红豆杉中差异较小。7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇在南方红豆杉中含量最高。7种紫杉烷类化合物总含量在东北红豆杉中最高，南方红豆杉其次，曼地亚红豆杉中最低。

3 结 论

本研究开发了一种高效、可同时测定红豆杉属植物中7种紫杉烷类化合物的HPLC的检测方法：色谱柱HiQsil C18(250 mm × 4.6 mm, 5 μm)；流动相：乙腈-水，梯度洗脱(0～10 min，30%乙腈；10～12 min，30%～45%乙腈；12～25 min，45%乙腈；25～30 min，42%～45%乙腈；30～40 min，30%～42%乙腈)；流速为1 mL/min；进样量为10 μL，柱温为30 ℃；紫外检测波长为227 nm。

7种紫杉烷类化合物的总含量在东北红豆杉中最高，南方红豆杉次之，曼地亚红豆杉中最低。通过对红豆杉属植物中主要紫杉烷类成分含量的对比分析，为红豆杉属植物的质量控制、种源选育、资源的保护与合理开发利用提供依据。