基于传统培养和高通量测序分析德州扒鸡优势腐败菌及相关抑菌剂价效评定

丛筠格，梁 杉，张 敏,

（1.北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京工商大学，北京 100048；2.北京工商大学食品与健康学院，北京 100048）

德州扒鸡作为我国传统酱卤肉制品，因风味独特受到消费者的喜爱。但酱卤肉制品在生产、加工和储运过程中，极可能被操作人员、加工设备和原料本身等所携带的细菌污染，在合适的环境条件下易腐败变质。目前德州扒鸡主要通过包装前高温灭菌处理或直接气调包装来延长货架期，但高温灭菌会影响产品口感和品质。气调包装是采用良好阻隔性包装材料并将食品周围气体进行更换或剔除的一种保藏方式，气调包装未经高温灭菌的德州扒鸡销售半径小，销售量易受到季节限制，已成为限制德州扒鸡产业发展的瓶颈。

研究德州扒鸡腐败菌相组成，有助于解决德州扒鸡乃至整个酱卤肉制品的货架期问题。随着科技的发展，食品中腐败微生物的研究方法逐渐增多，高通量测序作为新一代测序技术，具有信息量大、效率高的优点，能够更加准确、全面反映样本的微生物群落结构，但也存在难以确定具体菌种且无法区分细菌死活的缺点。传统培养技术可培养的条件有限，分析结果不能完全反映样品中微生物群落情况，但分离出的菌体纯度较高，可以验证高通量测序结果的准确性，因此在微生物研究中仍占有重要地位。将两种技术同时应用于菌相的研究，提高了检验通量和准确性。曹荣等将传统培养和高通量测序技术相结合研究牡蛎菌群结构，发现两种方法得到的结果一致。但目前将这两种方法同时应用在酱卤肉制品上的研究较少，且国内对于气调包装酱卤肉制品的研究处于初级阶段，对其致腐微生物菌群结构分析较少。

添加抑菌剂是抑制食品中腐败菌生长的常用方法。近年来，天然抑菌剂对酱卤肉制品中腐败菌的抑制作用研究逐渐增多，乳酸链球菌素（Nisin）用作为抑菌剂不会对食品的感观产生不良影响，因此在肉制品加工中有着广泛的应用。-聚赖氨酸（-poly-Llysine，-PL）复配抑菌剂用于肉制品的防腐保鲜，有提升保质期和口感的双重优势。茶多酚（tea polyphenols，TP）和溶菌酶（lysozyme，LZ）作为安全性较高的抑菌剂，在抑制肉制品细菌生长、维持肉制品品质等方面具有显著效果。李德红对气调包装酱鸭食管分离出的优势腐败菌进行抑菌研究，结果表明抑菌剂的最佳配方为-PL 0.05 g/kg、Nisin 0.2 g/kg、TP 0.12 g/kg；徐静等研究表明0.05% LZ、0.1%双乙酸钠、0.05% Nisin、3%乳酸钠的复合保鲜剂对红烧牛肉中微生物可以起到有效抑制作用。但由于贮藏条件及产品本身特性等原因，导致不同产品腐败的腐败菌也具有差异，目前针对低温贮藏条件下充氮包装德州扒鸡特定腐败菌的抑菌研究鲜有报道。

本研究将充氮包装的鸡肉在低温（4 ℃）条件下贮藏，通过高通量测序技术研究低温贮藏条件下菌群结构变化，并通过传统纯培养技术对腐败末期优势菌进行鉴定。结合文献报道有针对性地选择-PL、Nisin、TP、LZ 等天然抑菌剂，以单一抑菌效果为指标筛选出两种抑菌效果较好的抑菌剂，评价它们对各腐败菌的MIC，旨在为延长德州扒鸡的货架期和控制产品质量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

德州扒鸡 山东德州扒鸡股份有限公司；PCA培养基、LB 营养肉汤培养基 北京奥博星生物技术有限责任公司；PBS 缓冲液 北京索莱宝科技有限公司；-PL、Nisin 纯度99%，浙江新银象生物工程有限公司；TP 纯度98%，安徽红星药业股份有限公司；LZ 活性2000 U/mg，南宁庞博生物工程有限公司。

BC/BD-232HD 电冰柜 青岛海尔特种电冰柜有限公司；GR85DF 高压蒸汽灭菌锅 美国致微公司；BCL-1360 超净工作台 北京亚泰科隆仪器技术有限公司；THZ-82A 水浴恒温摇床 上海江星仪器有限公司；DHP-9162 恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；OLYMPUS BX53 生物显微镜 北京东方奥舟科技发展有限公司；F200 PRO 酶标仪 瑞士TECAN 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 德州扒鸡贮藏条件及腐败时间点的确定 通过文献查阅可知，气调包装酱卤肉制品通常货架期在11 d 左右，本实验所取德州扒鸡均为当天产品（从生产线取出到取样不超过3 h）。取样后立即进行菌落总数测定，剩下样品于4 ℃电冰柜中贮藏。每隔2 d 进行一次取样，菌落总数测定方法参照GB 4789.2-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验菌落总数测定》，以超过国家标准的菌落总数时间点作为腐败末期时间点。

1.2.2 德州扒鸡贮藏期间样本高通量测序分析 在低温4 ℃下贮藏，于贮藏0、2、4、6、8、10、12、14、16 d 取样进行高通量测序。将鸡肉样本送至上海美吉生物医药科技有限公司，委托其基于Illumina MiSeq 技术测序平台进行高通量测序。

1.2.3 德州扒鸡腐败末期微生物传统培养

1.2.3.1 腐败微生物的分离及纯化 选取腐败末期（16 d）的德州扒鸡进行菌株鉴定。选择30～300 CFU的PCA 平板，然后选择平板上形态不同的典型菌落，反复平板划线分离，最终得到纯化的单菌落，再将菌株保存于斜面上。

1.2.3.2 腐败微生物的鉴定 对优势腐败菌进行初步的菌落形态观察，包括菌落的颜色、形状、质地、光泽、隆起状况、粘稠度、透明度等。通过革兰氏染色，在光学显微镜下观察菌体个体形态和排列状况等。

将保存的菌株送往上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。测序结果在 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/上BLAST 上进行查询，相似度超99%即为同一菌属，用MEGA 7.0 软件构建系统发育树。

1.2.4 天然抑菌剂对优势腐败菌抑菌效价的评定

1.2.4.1 菌悬液的制备 在卢小菊等的方法上加以修改，把1.2.3 得到的优势腐败菌接种于LB 肉汤培养基，对其进行扩大培养至对数期，使用时用无菌生理盐水制成10～10CFU/mL 菌悬液。

1.2.4.2 单一防腐剂抑菌效果测定 在宋萌等方法上加以改进，制备不同浓度的单一防腐剂：参照GB 2760-2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》食品添加剂最大允许使用范围，分别制备含不同浓度的ε-PL（250、150、 100、60、30、15、0 μg/mL）、Nisin（500、 250、150、 100、 60、 30、 15、 0 μg/mL）、TP（500、250、150、 100、60、30、15、0 μg/mL）、LZ（500、250、150、100、60、30、15、0 μg/mL）的LB 培养基，向每组培养基中接入腐败微生物后，在37 °C，180 r/min 条件下培养12 h，分别测定OD，同时设置未添加防腐剂的空白对照组。

1.2.4.3 最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）的测定 在姚永杰等方法上稍加修改，采用微量二倍稀释法测定MIC 和MBC 值。称取一定量抑菌剂制成含有-PL、Nisin、TP、LZ 浓度分别为16000 μg/mL 的LB 培养基。在96 孔板中加入100 μL LB 培养基。在第一个孔中加入100 μL 抑菌剂溶液混匀，吸取100 μL 转移到顶行的下一个孔，依此类推进行倍比稀释至最后一列，混匀后弃掉100 μL。设置无菌组作阴性对照组，加细菌菌悬液组作阳性对照，每个孔中约有5×10CFU/mL 的供试菌。然后将装有细菌的微孔板放入37 °C 培养箱中静置培24 h。菌液清澈透明，无沉淀、絮状悬浮物或菌膜产生时抑菌剂的最低含量记为MIC。

在无菌条件下，从MIC 和大于MIC 浓度的孔中取出100 μL 培养液涂于PCA 平板，37 °C 培养24 h 后观察菌落生长情况，没有菌落生长的最低的浓度为该抑菌剂的MBC。

1.3 数据处理

所有实验重复三次，高通量测序数据结果利用生信云平台（https://cloud.majorbio.com/）进行分析处理，采用Origin 软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 腐败时间点的确定

德州扒鸡4 ℃贮藏过程中的菌落总数变化如图1 所示，从图中可以看出德州扒鸡的初始菌落数在2.4 lg（CFU/g）。0～12 d 菌落总数增长缓慢，主要是由于无氧的环境及较低的温度抑制了产品中残存的微生物快速繁殖，此时微生物需要一定的时间即迟滞期以适应新环境，12～14 d 菌落总数急剧增长，这主要是由于微生物在适应了较低的温度后开始快速生长繁殖，第12 d 时菌落总数达到5.1 lg（CFU/g），已经超过了GB 2726-2016《食品安全国家标准 熟肉制品》中酱卤肉制品菌落总数不得超过5.0 lg（CFU/g）的标准，所以12 d 为德州扒鸡4 ℃贮藏条件下的腐败时间点。在第14～16 d 菌落总数变化较为平稳，是由于微生物繁殖到一定密度后，会出现微生物之间的相互拮抗作用。

图1 德州扒鸡4 ℃贮藏过程中的菌落总数变化Fig.1 Changes of total bacterial count of Dezhou-braised chicken during storage at 4 ℃

2.2 高通量测序结果分析

2.2.1 德州扒鸡贮藏期间微生物群落的多样性分析多样性分析可以反映样品中微生物的多样性，主要包括Shannon 指数、Simpson 指数、Ace 指数、Chao 指数和Coverage 指数等多种指数，其中Ace指数和Chao 指数反映群落的丰富度，Simpson 指数和Shannon 指数反映群落的多样性，Coverage 指数反映群落的覆盖度。本研究对不同贮藏时间的德州扒鸡样品进行高通量测序，通过最小样本数进行抽平，根据97%的相似度进行聚类。结果如表1 所示，研究结果表明，Shannon 指数随着贮藏时间的延长逐渐降低，Simpson 指数呈现逐渐增加的趋势，说明样品贮藏初期菌群多样性较高，随着贮藏时间的延长，菌群多样性逐渐降低，群落物种均匀度逐渐下降。Ace 指数和Chao 指数在贮藏前期呈现动态变化，贮藏中后期降低趋势较为明显，说明德州扒鸡细菌菌群丰富度前期随着贮藏时间的延长不断变化，可能由于初期菌群未适应环境变化，贮藏后期丰富度逐渐降低，此时出现优势菌属。

稀疏曲线可以反映样品的取样深度（图2），随着测序深度的增加，各样本的稀释度逐渐趋于平缓，表明送测样本能够充分反映其微生物多样性情况。结合不同贮藏时间样本的测序深度指数Coverage 指数（见表1）均大于99%，表明送测样本的测序结果可以反映实际贮藏情况。

图2 不同贮藏时间德州扒鸡样品细菌群落的Sobs 曲线（a）和Shannon 曲线（b）Fig.2 Sobs curve (a) and Shannon curve (b) of bacterial community of Dezhou-braised chicken samples at different storage times

表1 德州扒鸡贮藏过程中细菌群落的多样性分析Table 1 Diversity analysis of bacterial community in Dezhou-braised chicken during storage

2.2.2 德州扒鸡贮藏期间群落组成分析 如图3 所示，在贮藏前期（0～4 d），细菌种类复杂多样，且各细菌所占比例均不高。嗜冷杆菌属（sp）在整个贮藏过程中都占有绝对优势，在0～10 d 贮藏期间数量逐渐增加，在腐败末期（12 d）其数量相对10 d 减少了0.69%，但其相对丰度达仍到76.97%，在贮藏后期（12～16 d），其数量呈现逐渐降低的趋势。假交替单胞菌属（sp）在达到腐败末期前比例相对很低，但到了贮藏后期占比突然升高，在贮藏末期（16 d）相对丰度达到51.00%，与sp同时成为优势菌属，似乎表明贮藏后期的条件更有利于其生长。而sp在贮藏后期可能受到了sp的竞争。在腐败末期时，假单胞菌（sp）相对丰度达到7.34%，肉食杆菌（sp.）相对丰度为4.35%，大球菌（sp）相对丰度为2.59%，气球菌（sp）相对丰度为1.45%。

图3 德州扒鸡贮藏过程中细菌群落在属水平的分布情况Fig.3 Distribution of bacterial community at genus level of Dezhou-braised chicken during storage

Gram 等报道，在贮藏过程中，食品中的微生物在初期种类多、结构复杂，随贮藏时间的延长，最终一种或几种微生物会在与其他细菌竞争过程中处于优势地位，或产生抑制其他微生物生长的代谢产物，抑制其他微生物的生长而成为优势菌群,与此研究结果相符。

2.3 传统培养分析结果

高通量测序分析结果可知，sp是德州扒鸡腐败过程的优势菌属。通过传统培养进行腐败末期优势菌的分离鉴定，共得到七株代表性显著的菌株，分别编号为B1～B7，其菌落形态如图4 所示。通过革兰氏染色判定菌株B1、B2、B6、B7 为革兰氏阳性菌，菌株B3、B4、B5 为革兰氏阴性菌。

图4 德州扒鸡优势腐败菌的培养特征和细胞形态（100×）Fig.4 Culture characteristics and cell morphology of dominant spoilage bacteria in Dezhou-braised chicken (100×)

将纯化培养的菌株进行测序，所得序列结果用Blast 进行比对，选取同源性最高的序列，利用MEGA7.0 软件构建系统发育树。结果如图5 所示，菌株B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7 分别与广布肉杆菌（）、水域微小杆菌（）、血嗜冷杆菌（）、变形斑沙雷氏菌（）、隆德假单胞菌（）、溶酪大球菌（）、绿色气球菌（）的相关序列相似度达到99%以上。

图5 基于16S rRNA 基因序列的系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence

综上所述，通过分离鉴定，结合菌落形态特征可知，气调包装德州扒鸡在4 ℃贮藏条件下优势腐败细菌主要为广布肉杆菌（）、水域微小杆菌（）、血嗜冷杆菌（）、变形斑沙雷氏菌（）、隆德假单胞菌（）、溶酪大球菌（）、绿色气球菌（）。对比图3 可知，五种分离得到的腐败菌均属于腐败末期高通量测序结果中的菌属，对比高通量测序结果可知微小杆菌（sp.）和沙雷氏菌（sp）在腐败末期相对丰度仅为0.04%和0.06%，可能因为所占比例过少图中未显示。

2.4 天然抑菌剂抑菌价效的评定

2.4.1 单一抑菌剂抑菌效力 选用-PL、Nisin、TP、LZ 四种常见的天然抑菌剂对德州扒鸡分离出的七种腐败菌进行抑菌能力测定，结果如图6 所示。

图6 不同天然抑菌剂对腐败细菌的抑制效果Fig.6 Inhibitory effects of different natural antimicrobial agents on spoilage bacteria

-PL 和TP 是广谱抑菌剂，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有较好的抑菌效果，从图6（a）可以看出，随着-PL 浓度的增加，腐败细菌的OD值下降趋势明显，表明在国标范围（0～250 μg/mL）内，-PL 能有效抑制腐败细菌的生长。当-PL 浓度为250 μg/mL，腐败细菌OD接近0，所有细菌的生长被完全抑制，其抑菌效果显著。从图6（d）可以看出，当TP 浓度达到250 μg/mL 时，仅能抑制、、的生长，当浓度达到国家规定标准500 μg/mL 时，仍未能抑制的生长，相较-PL 抑菌效果较差。

从图6（b）可以看出，当Nisin 浓度为60 μg/mL时，可以抑制除两种腐败菌外所有细菌的生长，对其他五种细菌的抑菌效果优于-PL。从图6（c）可以看出，当LZ 浓度达到500 μg/mL，仅能抑制两种腐败菌的生长，此浓度已达到国家规定标准上限，说明其抑菌效果与Nisin 相比较差。前人的研究中，生物抑菌剂Nisin 和LZ 对革兰氏阳性菌大多比革兰氏阴性菌具有更好的抑菌作用，但李伟丽等从腐败醋酸中分离出13 种细菌，其中包含革兰氏阴性菌耐酸乳酸菌，用Nisin 分别对分离出的菌株进行抑菌实验，结果显示Nisin 对耐酸乳酸菌也表现为强烈杀菌效果。在本实验中，Nisin 对革兰氏阴性菌也具有较好的抑菌效果，与李伟丽等研究结果相似。这可能与受试菌本身的特性有关，其抑菌机理有待进一步研究。

由于为德州扒鸡腐败末期的优势腐败菌，四种天然抑菌剂对该菌株的抑菌效果比较可知：Nisin＞-PL＞LZ＞TP，但由于Nisin 对两种腐败菌抑菌效果较差，故选用-PL 和Nisin 两种天然抑菌剂进行下面的抑菌试验。

2.4.2 最小抑菌、杀菌浓度的测定 采用微量二倍稀释法测定-PL 和Nisin 两种抑菌剂对分离出的七株腐败菌MIC 及MBC 值，结果如表2 所示，-PL对供试菌株的MIC 为15.63～250 μg/mL，在国标范围内能够有效抑制腐败菌的生长，Nisin 对七株供试菌的抑制效果由强到弱依次为：B7＞B2＞B6＞B1=B3＞B4=B5，对德州扒鸡优势腐败菌的抑菌效果显著。

表2 两种天然抑菌剂的MIC、MBCTable 2 MIC and MBC of two natural bacteriostatic agents

3 讨论与结论

气调包装酱卤肉制品的二次污染环节较多，导致产品中初始污染微生物种类和数量各不相同，对酱卤肉制品的质量安全产生重要影响。本文采取高通量测序技术，研究整个贮藏过程中菌落结构变化，发现sp为德州扒鸡4 ℃贮藏过程中的优势菌属。sp耐盐、渗透耐压性强，且低温酶使其可适应寒冷环境，因此在本产品中具有一定的致腐作用。叶可萍等运用传统细菌平板培养对气调包装酱卤鸭翅15 ℃贮藏过程中菌群结构分析表明sp为产品贮藏末期的优势菌。刘均等研究不同包装方式对货架期冷鲜鸡微生物菌相变化的影响，研究表明占比量最高，与本研究结果一致。本文结合传统培养技术，分离出德州扒鸡贮藏末期七种腐败菌。其中sp.sp.sp.等都是气调包装鲜肉中的常见菌。赖宏刚研究表明酱卤制品36 ℃贮藏条件下腐败末期优势菌以假单胞菌和乳酸菌为主。与本实验研究结果差异较大，可能是由于不同贮藏温度导致样品腐败的优势腐败菌不同。嗜冷菌一般是在-15～20 ℃之间最适宜生长，而普通细菌适应生长温度为25～40 ℃，故在低温条件下贮藏的肉制品更有利于嗜冷菌的生长。

天然抑菌剂来源于天然的动植物或微生物，因安全环保成为食品防腐保鲜的研究热点。通过四种天然抑菌剂对七种腐败菌抑菌能力的比较，-PL 和Nisin 均能有效抑制腐败菌的生长，其中-PL 对的抑菌能力较强，MIC 为15.63 μg/mL。-PL 由链霉菌好氧发酵产生，能在人体内分解为赖氨酸，可完全被人体消化吸收，对人体无任何副作用。Nisin 作为一种新型多肽，食用后在消化道中很快被蛋白水解酶分解成氨基酸，不会改变肠道内的正常菌群或与其它抗生素出现交叉抗性，是目前世界上唯一允许被用作食品添加剂的细菌素。-PL 抑菌性与其对菌体细胞壁和细胞膜系统的破坏有关，而Nisin 主要作用于菌体细胞膜，孔道理论认为Nisin 可以通过使微生物细胞膜中形成孔道，导致细胞内三磷酸腺苷、核苷酸以及氨基酸等小分子物质快速流出，细胞的生物合成过程受阻，从而使微生物细胞裂解死亡。

将高通量测序和传统培养方法结合起来可以更好地验证菌群构成，本研究通过高通量测序得到德州扒鸡腐败过程中的群落组成结构，通过传统培养分离得到腐败末期七种腐败菌，与高通量测序结果相对应，其中五种腐败菌占比较高。利用-PL、Nisin、TP、LZ 四种天然抑菌剂对分离得到的腐败菌进行抑菌试验，得到-PL 和Nisin两种抑菌剂对腐败菌具有较好的抑菌效果，为后续德州扒鸡的防腐保鲜提供了理论依据，但仍需进一步采集不同时间点德州扒鸡的腐败菌样品，确定不同季节导致德州扒鸡腐败变质的微生物是否存在差异，以期阐明季节变换对德州扒鸡腐败时间的影响及腐败机制。