健脾益肺鼻炎方标准汤剂特征图谱的建立及4种指标成分的含量测定Δ

宛鑫，李得堂，张丽娟，易美容，祝赫，何嘉仑，陈洁，唐洪梅，丘振文（1.广州中医药大学第一临床医学院，广州 510405；.广州中医药大学第一附属医院药学部，广州 510405；.广州中医药大学第一附属医院耳鼻喉科，广州 510405）

中药复方制剂的开发大多源于长期临床实践中积累的验方和经典名方，具有较强的临床优势及中医特色，其开发过程也遵循“临床-实验-回归临床”的规律[1-2]。健脾益肺鼻炎方为本课题组临床专家应用了10多年的临床验方，主要用于肺气虚寒型变应性鼻炎疾病的治疗。该方由黄芪、白术、防风、干姜、桂枝等8味中药组成，是在玉屏风散、桂枝汤、黄芪桂枝五物汤、辛夷散等经典名方基础上，经多年临床实践，不断加减化裁而成，具有健脾益肺、散寒通窍、益卫固表的功效。临床研究表明，健脾益肺鼻炎方治疗肺气虚寒型变应性鼻炎具有可靠的临床疗效，长期服用可显著改善患者流涕、鼻塞、鼻痒和打喷嚏等症状，减轻鼻部炎症反应，降低患者复发率[3]。药理实验表明，方中君药黄芪的有效成分黄芪多糖可通过抑制NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3、核转录因子κB和胸腺基质淋巴细胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）等炎症因子的表达，显著改善卵清蛋白诱导的变应性鼻炎模型大鼠的黏膜炎症反应[4-5]。为深入研究健脾益肺鼻炎方发挥疗效的物质基础，本研究以复方水煎液为模式标准，参照标准汤剂制备原则和《医疗机构中药煎药室管理规范》制备原则[6]，拟建立其标准汤剂的特征图谱，筛选影响其质量的主要指标成分，并对其进行含量测定，旨在为该方标准汤剂的质量控制和进一步开发提供物质基准。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器有1260型HPLC仪（美国Agilent公司）、MS-105DN型十万分之一分析天平（瑞士Metter Toledo公司）、TG16-WS型台式高速离心机（长沙湘智离心机仪器有限公司）、KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）等。

1.2 主要药品与试剂

升麻素苷对照品（批号RFS-S00411804028）、升麻素对照品（批号S-007-180427）、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品（批号J-002-180731）、亥茅酚苷对照品（批号H-027-180426）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品（批号M-020-190219）、毛蕊异黄酮对照品（批号M-021-180926）、芒柄花素对照品（批号C-018-181216）、木兰脂素对照品（批号RFS-M03111808031）均购自成都瑞芬思生物科技有限公司，纯度均大于97%；乙腈、甲醇均为色谱纯，磷酸为分析纯，水为蒸馏水。

黄芪、白术等8种中药饮片均购自广州中医药大学第一附属医院，由该院药学部李得堂副主任中药师鉴定均为真品。10批健脾益肺鼻炎方中8种中药饮片的来源信息见表1。

表1 10批健脾益肺鼻炎方中8种中药饮片来源信息

2 方法与结果

2.1 HPLC特征图谱的建立

2.1.1 标准汤剂的制备 取健脾益肺鼻炎方全方饮片（黄芪、麸炒白术、防风、桂枝、干姜、桔梗、辛夷、白芷各适量），以10倍量水（mL/g）浸泡30 min，先武火煮沸后文火煎煮60 min，滤过；药渣加入8倍量水（mL/g），先武火煮沸后文火煎煮40 min，过滤；合并2次滤液，小火浓缩至300 mL，即得标准汤剂，冷冻备用[6]。

2.1.2 供试品溶液的制备 吸取“2.1.1”项下标准汤剂适量，以4 000 r/min离心20 min，精密量取上清液2 mL，加甲醇定容至10 mL，摇匀，以4 000 r/min离心10 min，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 混合对照品溶液的制备 取升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素和木兰脂素对照品各适量，置于同一量瓶中，加甲醇溶解并定容至10 mL，制成上述各对照品质量浓度分别为21.3、15.6、16.0、19.5、20.3、15.5、13.9、17.0 μg/mL的混合对照品溶液。

2.1.4 色谱条件色谱柱为YMC Hydrosphere C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B）为流动相进行梯度洗脱（0～10 min，15%A；10～28 min，15%A→23%A；28～36 min，23%A→31%A；36～41 min，31%A→32%A；41～46 min，32%A→40%A；46～52 min，40%A→47%A；52～62 min，47%A→60%A；62～70 min，60%A→75%A）；流速为1 mL/min；柱温为30℃；检测波长为230 nm；进样量为10 μL。

2.1.5 精密度试验 取“2.1.2”项下供试品溶液（编号S1），按“2.1.4”项下色谱条件连续进样6次，以6号峰为参照峰（该峰分离度较好），计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，各共有峰相对峰面积的RSD均小于4.00%（n＝6），相对保留时间的RSD均小于1.00%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 取“2.1.2”项下供试品溶液（编号S1），分别于室温下放置0、2、4、8、12、24 h时按“2.1.4”项下色谱条件进样测定，以6号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，各共有峰相对峰面积的RSD均小于4.00%（n＝6），相对保留时间的RSD均小于1.00%（n＝6），表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定。

2.1.7 重复性试验 取“2.1.1”项下标准汤剂（编号S1），按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，再按“2.1.4”项下色谱条件进样测定，以6号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，各共有峰相对峰面积的RSD均小于4.00%（n＝6），相对保留时间的RSD均小于1.00%（n＝6），表明方法重复性良好。

2.1.8 特征图谱的建立及共有峰的指认 分别精密吸取10批次健脾益肺鼻炎方标准汤剂，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.4”项下色谱条件进样测定。将所得的10批标准汤剂的HPLC色谱图以“AIA”格式文件导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004版）》进行分析，以S7样品的HPLC色谱图为参照图谱（该批样品色谱峰分离度较好），6号峰为参照峰，采用中位数法生成10批样品的叠加特征图谱和对照特征图谱（R）。结果，10批健脾益肺鼻炎方标准汤剂共标定出24个共有特征峰（图1）。经与“2.1.3”项下混合对照品的色谱图比对，共指认了8个特征峰，分别是升麻素苷（2号峰）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（4号峰）、升麻素（5号峰）、5-O-甲基维斯阿米醇苷（6号峰）、亥茅酚苷（12号峰）、毛蕊异黄酮（15号峰）、芒柄花素（19号峰）和木兰脂素（21号峰）。结果见图2。

图1 10批健脾益肺鼻炎方标准汤剂的HPLC叠加特征图谱与对照特征图谱（R）

图2 混合对照品溶液和健脾益肺鼻炎方标准汤剂供试品溶液的HPLC图

2.1.9 相似度评价 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004版）》对10批健脾益肺鼻炎方标准汤剂进行相似度评价。结果显示，10批样品的相似度分别为0.993、0.968、0.991、0.981、0.994、0.995、0.991、0.989、0.993、0.997，相似度均大于0.960，表明10批次样品相似度较高，化学组分大致相同，质量相对稳定。

2.2 化学计量法分析

2.2.1 聚类分析 将10批健脾益肺鼻炎方标准汤剂的24个共有特征峰峰面积量化处理，用SPSS 26.0软件分析，采用瓦尔德联接方法，数据以平方欧氏距离为测距，进行聚类分析（cluster analysis，CA）。结果见图3。结果显示，当平方欧氏距离为10时，10批样品聚为3类，S1、S2和S10聚为一类，S3～S7聚为一类，S8、S9聚为一类。

图3 10批样品CA树状图

2.2.2 主成分分析 以24个共有特征峰峰面积为初始数据，用SPSS 26.0进行主成分分析（principal component analysis，PCA）。以特征值＞1为提取标准，共确定出4个主成分，累计方差贡献率为87.509%，表明这4个主成分对健脾益肺鼻炎方标准汤剂质量评价具有良好的代表性。结果见表2（表中仅展示前4个主成分的相关数据）。以24个共有特征峰峰面积为变量，导入SIMCA 14.1软件进行PCA，结果见图4。结果显示，10批次样品可聚为3类，与CA结果一致。

表2 PCA的特征值和方差贡献率

图4 10批样品的PCA图

2.2.3 正交偏最小二乘法-判别分析 采用SIMCA 14.1软件对10批健脾益肺鼻炎方标准汤剂的24个共有特征峰峰面积进行正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）。结果显示，其模型解释率参数R2X、R2Y和预测能力参数Q2分别为0.962、0.996、0.649，均大于0.5，说明该模型具有较好的拟合能力及预测能力[7]。以变量重要性投影（variable important in projection，VIP）值＞1.5作为筛选标准确定影响样品的差异变量（变量VIP值越高，对组间差异的影响越大），结果见图5。由图5可见，共有3个共有特征峰的VIP值＞1.5，依次为升麻素苷（2号峰）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（4号峰）、5-O-甲基维斯阿米醇苷（6号峰），表明这3个成分可能是影响健脾益肺鼻炎方标准汤剂质量差异的主要化学成分。

图5 24个共有特征峰OPLS-DA的VIP值图

2.3 含量测定

2.3.1 线性关系考察 精密吸取“2.1.3”项下混合对照品溶液0.5、1、2、4、8、10 μL，按“2.1.4”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以各待测成分峰面积为纵坐标（Y）、进样量为横坐标（X）进行线性回归。结果，各成分在各自线性范围内线性关系良好，详见表3。

表3 各成分线性回归方程和线性范围

2.3.2 精密度试验 精密量取“2.1.2”项下供试品溶液（编号S1），按“2.1.4”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果显示，升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、升麻素和5-O-甲基维斯阿米醇苷峰面积RSD分别为0.17%、0.38%、0.36%、0.13%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.3.3 稳定性试验 精密量取“2.1.2”项下供试品溶液（编号S1），分别于室温下放置0、2、4、8、12、24 h时按“2.1.4”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果显示，升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、升麻素和5-O-甲基维斯阿米醇苷峰面积的RSD分别为0.21%、1.34%、1.00%、0.18%（n＝6），表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定性良好。

2.3.4 重复性试验 精密量取“2.1.1”项下健脾益肺鼻炎方标准汤剂（编号S1），按“2.1.2”项下条件平行制备6份供试品溶液，再按“2.1.4”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，采用外标法计算样品含量。结果显示，升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、升麻素和5-O-甲基维斯阿米醇苷含量的RSD分别为0.17%、0.38%、0.36%、0.13%（n＝6），表明方法重复性良好。

2.3.5 加样回收率试验 取升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品各适量，分别加甲醇溶解并定容至10 mL，配制成质量浓度为163、107、103、120 μg/mL的对照品溶液。精密量取健脾益肺鼻炎方标准汤剂（编号S5）1 mL，共6份，按质量比1∶1精密加入各对照品溶液，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.4”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率。结果显示，4种成分的平均加样回收率分别为105.98%、98.06%、96.38%、104.17%，RSD分别为1.75%、3.87%、4.03%、1.27%，表明方法准确度良好，结果见表4。

表4 4种成分加样回收率试验结果（n＝6）

2.3.6 样品含量测定 精密量取10批次健脾益肺鼻炎方标准汤剂，按“2.1.2”项下方法制备10批供试品溶液，再按“2.1.4”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按外标法计算样品含量。每个样品平行测定3次，取平均值。结果见表5。

表5 4种成分的含量测定结果（n＝3，μg/mL）

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

本研究在建立特征图谱时，分别考察了Agilent ZORBAX Eclipes Plus C18、YMC Hydrosphere C18、Kromasil C183种色谱柱，结果发现YMC Hydrosphere C18分离效果最好，出峰多且峰形较佳。又分别考察了甲醇-水、乙腈-水为流动相时的分离效果，结果发现，乙腈-水为流动相时色谱峰分离效果较优。为改善峰形及基线，分别考察了不同体积分数的磷酸溶液（0.02%、0.05%、0.1%），结果表明，0.05%磷酸溶液可较好地改善峰形和分离度，且色谱峰基线平稳。因此，选择乙腈-0.05%磷酸溶液作为流动相。又分别对不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）进行了考察，结果表明，在1.0 mL/min的流速下，色谱峰之间的分离度更优。本研究还考察了200～400 nm波长范围内的色谱峰效果，结果发现在230 nm下，各峰之间分离度较好，吸收峰多且基线平稳，故选择230 nm作为检测波长。

3.2 健脾益肺鼻炎方标准汤剂特征图谱的建立及定量指标的选择

中药复方标准汤剂为中医临床用药的主要形式，其作为一种标准物质和标准体系，可保障临床药效和质量的一致性[8-9]。本研究收集了临床在用的10批处方饮片，以复方标准水煎液为模式标准，建立了化学特征图谱和对照标准色谱图，共确定了24个共有特征峰，相似度均大于0.960。通过与对照品比对，共指认出8个色谱峰。化学计量法CA、PCA和OPLS-DA评价结果显示，10批样品可分为3类，S1、S2和S10聚为一类，S3～S7聚为一类，S8、S9聚为一类；VIP值＞1.5的色谱峰主要有3个，依次为升麻素苷（2号峰）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（4号峰）、5-O-甲基维斯阿米醇苷（6号峰），推测以上3个成分可能是影响样品质量差异的主要化学成分。

上述分析中，升麻素虽不是影响健脾益肺鼻炎方标准汤剂质量的重要差异成分，但多种研究表明，升麻素具有较强的抗炎作用[10-11]，可通过调节上皮细胞间的紧密连接，降低相关炎症因子TSLP和白介素33的表达，显著抑制异硫氰酸荧光素诱导的小鼠过敏性皮炎[12]。因此，笔者建议可将升麻素也作为健脾益肺鼻炎方标准汤剂质量控制的指标成分，即将升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素4种成分共同作为HPLC的含量测定指标。含量测定结果显示，4种成分的含量分别为 12.12～18.87、3.86～6.40、3.10～4.27、11.17～15.79 μg/mL，各批次成分含量测定具有一定的差异，可能与药材采收时间、采收地点、产地加工方式等多种因素有关，再次表明对该方标准汤剂建立全面规范的质量控制体系具有必要性。

综上所述，本研究建立的HPLC特征图谱方法稳定可行，可用于健脾益肺鼻炎方的质量控制；升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、升麻素和5-O-甲基维斯阿米醇苷可作为该方标准汤剂质量控制的指标成分。