三棱莪术汤对膝骨关节炎大鼠的影响及作用机制

欧阳峰松 向忠军 熊瑛 丁乐 刘桐言

(1新型药物制剂研发湖南省重点实验室，湖南 长沙 410219；2长沙医学院中医学院)

膝骨关节炎是一种慢性关节疾病，以软骨下硬化、软骨侵蚀、骨赘形成等病理变化为特征〔1〕。受我国人口老龄化和肥胖人数增加的影响，膝骨关节炎的发病率呈逐年上升趋势〔2〕；世界卫生组织统计结果显示，全球范围内60岁以上老年人中10%患有膝骨关节炎，主要表现为关节僵硬、疼痛，严重影响日常生活质量，是主要致残原因之一〔3〕。手术治疗和药物保守治疗能够有效延缓膝骨关节炎的发展，但长期服用非甾体抗炎药、软骨保护剂的疗效不佳，胃肠道不良反应较为明显〔4〕。祖国传统医学将骨关节炎归为“痹症”的范畴，治疗以温通化瘀为主。三棱莪术汤最早见于《经验良方》中的三棱丸，可破血逐瘀，常用于治疗妇科疾病〔5〕，该方亦能够体现中医治疗骨关节炎的整体观念，但目前尚无治疗膝骨关节炎的研究报道。本课题组前期基于网络药理学研究结果发现，炎症因子肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(INF)-γ、白细胞介素(IL)-17可能参与膝骨关节炎的发生与进展。本研究旨在探讨三棱莪术汤对膝骨关节炎大鼠模型的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 健康清洁级SD大鼠72只，12周龄，体重160～200 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，实验动物许可证号：SYXK(湘)2019-0017。饲养条件：温度20～24℃，湿度50%～60%，每日灯光照明12 h，模拟昼夜交替，自由饮水和进食。

1.2实验药物及主要试剂、仪器 三棱莪术汤制备：三棱10 g，莪术10 g，红花10 g，没药10 g，乳香10 g，丹参15 g，桃仁15 g，赤芍15 g，天花粉20 g，加入3 L水，加热煮至1 L，进一步浓缩成10 g/ml。塞来昔布胶囊(辉瑞制药有限公司，国药准字J20140072，0.2 g)溶于0.9%氯化钠溶液。Trizol试剂盒购于上海通蔚生物有限公司；鼠抗人含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)1单克隆抗体，鼠抗人核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白(NLRP)3多克隆抗体，鼠抗人GAPDH单克隆抗体均购于广州泛思生物有限公司；TNF-α、INF-γ、IL-17 酶联免疫吸附试剂盒购于上海百千生物有限公司，VeritiPro热循环仪购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司，TGL-16E高速冷冻离心机购于济南爱来宝仪器设备有限公司，手持式组织匀浆机购于美国Biospec公司。

1.3造模与分组给药 模型组、塞来昔布组、三棱莪术汤不同剂量组全麻后固定在手术台，左后肢膝关节内侧备皮，髌骨内侧纵切口，剪断膝关节内侧副韧带和前后交叉韧带，并去除半月板。无菌生理盐水冲洗膝关节后缝合、包扎、固定，术后连续3 d肌肉注射青霉素，剂量为480 mg。根据成年人给药剂量估算大鼠用药量，塞来昔布组、三棱莪术汤不同剂量组造模成功首日开始给药，塞来昔布组以100 mg/kg剂量灌胃；三棱莪术汤不同剂量组分别以20、40、80 mg/kg剂量灌胃，连续3个月，对照组和模型组以相同体积生理盐水灌胃。3个月后测定大鼠机械痛阈和热刺激潜伏期，进行关节炎症积分和光镜软骨检测(Mankin)评分。

1.4标本采集与苏木素-伊红(HE)染色 造模3个月后处死各组大鼠，切除左后肢膝关节胫骨平台软骨组织，取其中部分软骨组织浸于甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋；另外的软骨组织清洁后放入液氮中保存备用。取石蜡包块，4 μm连续切片，二甲苯固定，梯度乙醇脱蜡，苏木素染色1 min，水洗后用1%氨水返蓝1 min，放入伊红染液中数秒后水洗，梯度乙醇、二甲苯处理后中性树胶封固，光学显微镜下观察。

1.5RT-PCR检测Caspase1、NLRP3 mRNA表达 Trizol试剂盒提取各组膝关节软骨组织总RNA，逆转录得到cDNA。PCR扩增引物由上海毓秀生物科技有限公司设计合成。Caspase1上游引物：5′-TTATGGAGCCTGGACGTGACCTATGCTG-3′，下游引物：5′-CAAGGTATAAACAGCATAGGTCACGAC-3′。NLRP3上游引物：5′-AGCCTGGGACGTGACCTATGCTG-3′，下游引物：5′-CAAGGTATAAACAGGCATAGGAC-3′。GAPDH上游引物：5′-GCAAATGACG CTGAAGGTGGC-3′，下游引物：5′-CCGAGTAGGTA CTGTTGAACGA-3′。PCR体系15 μl，包括dNTP Master Mix 5 μl、上游引物1 μl、下游引物1 μl、RNA模版 2 μl、蒸馏水6 μl。反应条件：95℃预变性4 min，95℃变性30 s，56℃复性30 s，共40个循环，72℃延伸1 min。以参照基因GAPDH为标准进行相对定量。

1.6Western印迹检测Caspase1、NLRP3蛋白表达 苯甲酸磺酰氟裂解液提取各组大鼠膝关节软骨组织总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)试剂盒测定蛋白浓度，行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离并将目标蛋白转移至硝酸纤维素膜，使用含5%牛血清白蛋白的TBST缓冲液室温下封闭30 min，滴加一抗：鼠抗人Caspase1单克隆抗体(1∶300稀释)，鼠抗人NLRP3多克隆抗体(1∶500稀释)，鼠抗人GAPDH单克隆抗体(1∶1 000稀释)，4℃孵培育过夜；次日加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG(1∶1 000稀释)，室温下孵育1 h，电化学发光法(ECL)显影，使用Image J软件读取目标蛋白的相对水平。

1.7大鼠膝关节软骨组织中TNF-α、INF-γ、IL-17表达水平检测 取各组膝关节软骨组织，使用手持式组织匀浆机进行匀浆后，采用酶联免疫吸附试验检测膝关节软骨组织中TNF-α、INF-γ、IL-17表达水平，严格按试剂盒说明书进行操作。

1.8统计学分析 使用SPSS23.0统计学软件进行方差分析、t检验及χ2检验。

2 结 果

2.1各组膝骨关节炎症状评价指标比较 模型组机械痛阈、热刺激潜伏期明显低于对照组，关节炎症积分、Mankin评分明显高于对照组(P<0.01)；塞来昔布组、三棱莪术汤不同剂量组机械痛阈、热刺激潜伏期明显高于模型组，关节炎症积分、Mankin评分明显低于模型组(P<0.05)；随着三棱莪术汤剂量的增加大鼠机械痛阈、热刺激潜伏期逐渐提升，关节炎症积分、Mankin评分逐渐降低，其中80 mg/kg组与塞来昔布组差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组膝骨关节炎症状评价指标比较

2.2各组膝关节软骨病理学改变情况 对照组膝关节软骨组织无缺损，关节软骨和滑膜细胞排列整齐有序，软骨上层未见血管分布，无炎性细胞浸润，软骨下骨结构完整。模型组关节软骨细胞层变薄，骨细胞数量减少，存在凋亡软骨细胞，滑膜细胞排列紊乱，软骨下骨管腔增大，有炎性细胞浸润。塞来昔布组软骨表面呈毛刺样特征，软骨细胞数量明显多于模型组，且存在少量分裂情况，滑膜细胞紧密排列，小血管和炎性细胞数量减少。三棱莪术汤20、40 mg/kg组软骨表面较模型组平整度明显提升，存在少量软骨细胞增殖分裂，炎性细胞数量减少，分布有小血管。三棱莪术汤80 mg/kg组关节表面较平整与模型组无明显差异，炎性细胞浸润不明显，软骨细胞处于增殖状态，可见小血管。见图1。

图1 各组膝关节软骨病理学改变情况(HE染色，×200)

2.3各组Caspase1、NLRP3 mRNA和蛋白表达水平比较 模型组Caspase1、NLRP3 mRNA和蛋白表达水平明显高于对照组(P<0.01)；塞来昔布组、三棱莪术汤不同剂量组明显低于模型组(P<0.05)；随着三棱莪术汤剂量的增加均逐渐降低，其中80 mg/kg组与塞来昔布组差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.4各组TNF-α、INF-γ、IL-17表达水平比较 模型组TNF-α、INF-γ、IL-17表达水平明显高于对照组(P<0.01)；塞来昔布组、三棱莪术汤不同剂量组均明显低于模型组(P<0.05)；随着三棱莪术汤剂量的增加均逐渐降低，其中80 mg/kg组与塞来昔布组差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组Caspase1、NLRP3 mRNA和蛋白表达及TNF-α、INF-γ、IL-17表达水平比较

3 讨 论

骨关节炎属中医学“痹症”的范畴,病因为气血痹阻，筋骨失养，肝肾亏损，寒凝血瘀，极虚极实，缠绵难愈；病机多因肝肾亏虚,兼夹劳损或风寒湿邪入侵所致,局部气血瘀滞,不通则痛。《素问·痹论》曰“风、寒、湿三气杂至,合而为痹”“痹在于骨则重,在于脉则血凝而不流,在于筋则屈不伸,在于肉则不 仁”；《素问·长刺节论》曰“病在骨，骨重不可举，骨髓酸痛，寒气至，名曰骨痹”；《景岳全书》亦曰“痹者闭也，以气血为邪所闭，不得通行而为病也”。而三棱莪术汤中的三棱苦平辛散，入肝脾血分，为血中气药，长于破血中之气，能够破血祛瘀、行气止痛；莪术苦辛温香，入肝脾气分，为气中血药，善破气中之血，可破血行气，消积止痛〔6〕。二药伍用，气血双施，活血化瘀、行气止痛、化积消块力彰。故临床上常将三棱与莪术配伍，在行血气的同时还能够破气中之血，提升活血、理气、化瘀的功效。三棱莪术汤已广泛用于子宫肌瘤、卵巢癌、子宫内膜异位症、消化道肿瘤的治疗〔7～9〕，但对膝骨关节炎疗效和作用机制的研究仍未见报道。本研究结果提示三棱莪术汤能够有效减轻膝骨关节炎的软骨损伤程度，其中80 mg/kg剂量效果最为明显。进一步通过HE染色观察大鼠膝关节软骨病理学改变，结果显示，三棱莪术汤能够明显降低炎性细胞浸润水平，减轻膝骨关节炎软骨细胞的损伤程度，促进软骨细胞增殖、分裂。

Caspase1是Caspase家族首个被发现的成员，能够激活水解IL-18、IL-1β后启动病理级联反应，包括软骨基质金属蛋白酶激活等，进而降解关节软骨基质胶原〔10〕。相关研究显示，Caspase1诱发的软骨基质降解能够间接促进软骨细胞凋亡，破坏软骨细胞稳态进而损伤膝骨关节〔11，12〕。NLRP3炎性小体能够刺激炎性介质释放参与多种关节炎性疾病的发生与发展，可作为膝骨关节炎的潜在生物标志物〔13〕；通过抑制NLRP3表达能够缓解膝骨关节炎患者病情。近年来研究发现，NLRP3炎性小体激活后可活化下游Pro-Caspase1，被剪切成Caspase1发挥生物学作用，激活下游炎性因子，发挥炎症级联反应〔14〕。NLRP3/Caspase1信号通路在全身性炎症反应和局部炎症反应中起重要作用〔15〕。本研究结果提示NLRP3/Caspase1信号通路参与了膝骨关节炎软骨损伤过程，且可能为三棱莪术汤治疗膝骨关节炎的靶点之一。

TNF-α、INF-γ能够干扰软骨组织中胶原和蛋白聚糖的合成，并加速胶原和蛋白聚糖的分解，促进膝骨关节炎的软骨破坏〔16〕。相关研究显示，TNF-α能够上调滑膜细胞的基因表达，促进成纤维细胞增殖，进而使关节液中细胞因子水平上升，滑膜组织纤维变性加快，是膝骨关节炎病变过程的主要因子〔17〕。在膝骨关节炎大鼠模型中对软骨基质和细胞进行染色，INF-γ及其受体共同呈阳性表达，且INF-γ浓度与膝骨关节炎严重程度呈正相关〔18〕。IL-17能够通过影响巨噬细胞、IL-6、IL-8等多种细胞因子表达来参与膝骨关节炎的发生与发展。研究发现，滑膜细胞中IL-17表达可影响IL-8和IL-1β水平，同时增加一氧化氮的合成量〔19〕；IL-17还能与IL-6联合上调骨细胞中前列腺素(PG)E2和环氧酶(COX)-2表达，导致自由基失衡〔20〕。相关研究显示，TNF-α、INF-γ、IL-1β、IL-17等多种炎症因子表达受NLRP3/Caspase1信号通路调控〔21〕。本研究结果提示三棱莪术汤可能通过抑制NLRP3/Caspase1信号通路进而抑制下游炎症因子TNF-α、INF-γ、IL-17表达，达到减轻膝骨关节炎软骨损伤的作用，其中80 mg/kg给药剂量的效果最为明显。