长链非编码RNA前列腺癌相关转录本7对三阴性乳腺癌MDA-MB-436细胞增殖、迁移及侵袭的影响

朱方园，邵营波，陈 琦，贺亚宁，刘朝俊，聂 冰，刘 慧

(郑州大学人民医院/河南省人民医院乳腺外科，河南 郑州 450003)

女性乳腺癌现已超过肺癌成为全世界新发病例最多的恶性肿瘤，也是病死率最高的恶性肿瘤之一，2020年全世界约有230万女性乳腺癌新发病例，约占所有癌症新发病例的11.7%，占所有癌症致死病例的6.9%[1]。乳腺癌是一种异质性疾病，临床上按照免疫组织化学特点将其分为腔面A型(luminal A)、腔面B型(luminal B)、人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)过表达型及三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)[2]，根据不同分型拟定个体化治疗方案。TNBC患者的雌激素受体、孕激素受体及HER-2均为阴性，约占所有类型乳腺癌的15.0%[3]，具有发病年龄低、侵袭转移力强、预后差等特点[4]，目前缺乏有效的治疗靶点，因此,迫切需要寻找新的肿瘤标志物及治疗靶点以改善患者预后。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是长度大于200个核苷酸的不编码蛋白质的RNA分子，调控着包括乳腺癌在内的多种恶性肿瘤的发生、发展[5-7]。lncRNA 前列腺癌相关转录本7(prostate cancer associated transcript 7,PCAT7)是一种促癌基因，已证明其在非小细胞肺癌、鼻咽癌等多种恶性肿瘤中表达异常[8-9]。ZHOU等[10]首次报道了PCAT7在乳腺癌组织及细胞中表达异常，并促进癌细胞的增殖、迁移、侵袭，抑制细胞凋亡。但有关PCAT7在TNBC中的作用仍需进一步研究。本研究通过干扰TNBC MDA-MB-436细胞中lncRNA PCAT7的表达，探讨lncRNA PCAT7对TNBC MDA-MB-436细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响及相关机制，旨在为TNBC的治疗寻找潜在靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞人TNBC MDA-MB-436细胞购自美国ATCC细胞库，置于液氮中保存。

1.2 主要试剂与仪器lncRNA PCAT7小干扰RNA(lncRNA PCAT7-small interfering RNA,lncRNA PCAT7-siRNA)、control siRNA由上海吉玛制药技术有限公司设计并合成；siRNA转染试剂购自上海吉玛制药技术有限公司，Leibovitz′s L-15培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司，胰岛素、Tris缓冲生理盐水(Tris-buffered saline and 0.1% Tween-20,TBST)购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司，辣根过氧化物酶标记的二抗购自北京中杉金桥生物技术公司，青霉素-链霉素双抗购自生工生物工程(上海)股份有限公司，结晶紫染料购自天津市恒兴化学试剂制造有限公司，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS)购自武汉博士德生物工程有限公司，多聚甲醛购自国药集团(上海)化学试剂有限公司，超纯RNA提取试剂盒、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司，反转录及实时聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction,Real-Time PCR)试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司，Transwell小室及Western blot检测试剂盒购自美国Corning公司，放射免疫沉淀(radio-immunoprecipitation,RIPA)蛋白裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)上样缓冲液购自上海西唐生物有限公司，谷胱甘肽、胎牛血清购自以色列Biological Industries公司，胰蛋白酶、碘化丙啶(propidium iodide,PI)购自美国Sigma公司，Matrigel基质胶购自美国Corning公司，p27一抗购自美国SAB公司，电化学发光(electrochemiluminescence,ECL)检测试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司；Forma型CO2培养箱、NanoDrop 2000分光光度计购自美国Thermo公司，台式高速低温离心机购自德国Eppendorf公司，BD FACS Calibur流式细胞仪购自美国BD公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养与转染设计合成3种lncRNA PCAT7-siRNA及1种control siRNA，其中lncRNA PCAT7-siRNA1序列为5′-GUGGCAGAUACCACCUUAAATT-3′，lncRNA PCAT7-siRNA2序列为5′-CCCGUCUUUACUAAAUAUATT-3′，lncRNA PCAT7-siRNA3序列为5′-GUGCCAAGGAGACUCAAUATT-3′，control siRNA序列为5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′。将MDA-MB-436细胞从液氮中取出，置入预热至37 ℃的水浴锅中快速晃动，解冻后将细胞接种于含体积分数15%胎牛血清、体积分数1%青霉素-链霉素双抗、10 mg·L-1胰岛素、10 mg·L-1谷胱甘肽的Leibovitz′s L-15培养基中，置于37 ℃、含体积分数5% CO2培养箱中培养；取对数生长期MDA-MB-436细胞，胰蛋白酶消化，以细胞密度2×105L- 1接种于6孔板中继续培养，待细胞融合度达80%时，将细胞分为lncRNA PCAT7-siRNA1组、lncRNA PCAT7-siRNA2组、lncRNA PCAT7-siRNA3组3个干扰组和1个空载组，分别转染lncRNA PCAT7-siRNA1、lncRNA PCAT7-siRNA2、lncRNA PCAT7-siRNA3和control siRNA，转染6 h后更换为完全培养基，继续培养48 h，收集各组细胞，用于后续实验。

1.3.2 Real-Time PCR法检测转染后各组细胞lncRNA PCAT7表达情况收集转染 6 h后继续培养48 h的各组MDA-MB-436细胞，使用超纯RNA提取试剂盒提取总RNA，使用NanoDrop 2000分光光度计测定RNA纯度和浓度，使用反转录试剂盒对样本进行反转录获取cDNA，根据Real-Time PCR试剂盒说明书配制反应体系(20 μL)，lncRNA PCAT7正向引物序列为5′-AAACAAGCCAACCGCACAAT-3′，反向引物序列为5′-CCTGCTTGCTGTGTTACTGC-3′；内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)正向引物序列为5′-AAGACCTTGGGCTGGGACTG-3′，反向引物序列为5′-ACCAAATCCGTTGACTCCGA-3′。反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃循环反应10 s，60 ℃循环反应30 s，循环40次，溶解曲线95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，65 ℃ 15 s，重复35个循环。以GAPDH作为内参基因，采用2-△△Ct法计算lncRNA PCAT7 mRNA的相对表达量，实验重复3次，取均值，选择lncRNA PCAT7相对表达水平最低的干扰组MDA-MB-436细胞用于后续实验。

1.3.3 克隆形成实验检测MDA-MB-436细胞增殖能力取“1.3.2”项选定的、lncRNA PCAT7-siRNA3组和空载组MDA-MB-436细胞，继续培养48 h后，用胰蛋白酶消化细胞，使用“1.3.1”项配制的Leibovitz′s L-15培养基重悬细胞，用细胞计数板计数，以每孔1 000个细胞铺于6孔板中，将细胞置于37 ℃含体积分数5%CO2的培养箱中培养，每隔2 d更换1次培养基，培养14 d后，移去旧的培养基，PBS清洗1次，加入 40 g·L-1多聚甲醛室温固定30 min，移去多聚甲醛，PBS清洗2次，加入结晶紫，摇床上轻轻摇晃 30 min，移去结晶紫，PBS清洗，完全晾干，显微镜下观察，计算细胞克隆形成数目。实验重复3次，取均值。

1.3.4 划痕实验检测MDA-MB-436细胞迁移能力取“1.3.2”项选定的lncRNA PCAT7-siRNA3组和空载组MDA-MB-436细胞，继续培养48 h后，将细胞消化后重悬，接种于6孔板中，细胞单层融合后，移去培养基，使用 200 μL 移液器枪头垂直制作划痕，PBS轻轻洗去划下细胞及细胞碎片，加入完全培养基，分别于0、48 h 对各组细胞进行拍照，使用Image J软件测量划痕宽度并计算划痕愈合率。划痕愈合率=(0 h 划痕宽度-48 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。

1.3.5 Transwell小室实验检测MDA-MB-436细胞侵袭能力取“1.3.2”项选定的lncRNA PCAT7-siRNA3组和空载组MDA-MB-436细胞，继续培养48 h后，消化重悬细胞，调整细胞密度为5 × 108L-1，将200 μL细胞悬液接种于预先铺设稀释Matrigel胶的Transwell小室的上室，下室中加入600 μL 的体积分数20%胎牛血清完全培养基，37 ℃培养箱中静置48 h，弃去培养基，将小室置于含PBS的烧杯中轻轻涮洗3遍，40 g·L-1多聚甲醛室温固定1 h，洗去固定液后结晶紫室温染色30 min，PBS清洗3遍，晾干后显微镜下随机选取3个视野，计数穿膜细胞数，取均值。

1.3.6 流式细胞术检测MDA-MB-436细胞周期分布情况取“1.3.2”项选定的lncRNA PCAT7-siRNA3组和空载组MDA-MB-436细胞，继续培养48 h后，用胰蛋白酶消化细胞，1 500 r·min-1离心5 min，预冷PBS洗涤2次，加入预冷的体积分数75%乙醇，4 ℃固定4 h，离心去除乙醇，PBS洗涤1次，加入100 μL核糖核酸酶，37 ℃水浴30 min，加入400 μL PI染液，4 ℃避光孵育30 min，流式细胞仪上机检测各组细胞周期，重复3次，取均值。

1.3.7 Western blot法检测MDA-MB-436细胞p27蛋白表达情况取“1.3.2”项选定的lncRNA PCAT7-siRNA3组和空载组MDA-MB-436细胞，继续培养48 h后，使用预冷PBS洗涤2次，加入RIPA裂解液裂解细胞，充分震荡，冰上静置30 min，4 ℃ 13 500 r·min-1离心 20 min，收集上清，使用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。将上清与SDS-PAGE上样缓冲液混合，电泳30 min后转膜，脱脂牛奶室温封闭2 h，加入p27一抗(稀释度为1500)，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，每次10 min，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(稀释度为15 000)，室温孵育 2 h，TBST洗涤3次，每次10 min，洗涤后加入二抗室温下孵育 2 h，使用ECL发光液显影，吸去发光液，采用凝胶成像系统拍照，应用Image J软件分析目的条带灰度值，以目标蛋白条带灰度值与内参GAPDH条带灰度值的比值表示目标蛋白的相对表达量。实验重复3次，取均值。

2 结果

2.1 各组MDA-MB-436细胞中lncRNA PCAT7 mRNA相对表达量比较lncRNA PCAT7-siRNA1组、lncRNA PCAT7-siRNA2组、lncRNA PCAT7-siRNA3组及空载组MDA-MB-436细胞中lncRNA PCAT7 mRNA相对表达量分别为0.91±0.02、0.72±0.01、0.55±0.01及1.00±0.03。lncRNA PCATT-siRNA1组MDA-MB-436细胞中lncRNA PCAT7 mRNA相对表达量与空载组比较差异无统计学意义(t=-4.286,P>0.05)；lncRNA PCAT7-siRNA2组和lncRNA PCAT7-siRNA3组MDA-MB-436细胞中lncRNA PCAT7 mRNA相对表达量显著低于空载组，差异有统计学意义(t=-28.028、-47.748,P<0.05)；lncRNA PCAT7-siRNA3组MDA-MB-436细胞中lncRNA PCAT7 mRNA相对表达量显著低于lncRNA PCAT7-siRNA2组(t=12.705,P<0.01)，选择lncRNA PCAT7-siRNA3组MDA-MB-436细胞进行后续实验。

2.2 lncRNA PCAT7-siRNA3组与空载组MDA-MB-436细胞增殖能力比较培养14 d后，lncRNA PCAT7-siRNA3组和空载组MDA-MB-436细胞克隆形成数分别为(69.00±5.51)、(116.67±3.28)个,lncRNA PCAT7-siRNA3组MDA-MB-436细胞克隆形成数显著少于空载组，差异有统计学意义(t=-7.434,P<0.01)。

2.3 lncRNA PCAT7-siRNA3组与空载组MDA-MB-436细胞迁移能力比较结果见图1。细胞划痕培养48 h后，lncRNA PCAT7-siRNA3组和空载组细胞划痕愈合率分别为(13.52±1.69)%、(46.89±2.41)%，lncRNA PCAT7-siRNA3组MDA-MB-436细胞划痕愈合率显著低于空载组，差异有统计学意义(t=-11.340,P<0.01)。

A：lncRNA PCAT7-siRNA3组；B：空载组。

2.4 lncRNA PCAT7-siRNA3组与空载组MDA-MB-436细胞侵袭能力比较结果见图2。lncRNA PCAT7-siRNA3组和空载组MDA-MB-436细胞穿膜细胞数分别为(52.67±10.90)、(150.67±8.41)个；lncRNA PCAT7-siRNA3组MDA-MB-436细胞侵袭数显著少于空载组，差异有统计学意义(t=-7.120，P<0.01)。

A：lncRNA PCAT7-siRNA3组；B：空载组。

2.5 lncRNA PCAT7-siRNA3组与空载组MDA-MB-436细胞周期分布比较结果见图3和表1。lncRNA PCAT7-siRNA3组MDA-MB-436细胞G0/G1期细胞比例显著高于空载组，G2/M期细胞比例显著低于空载组，差异有统计学意义(t=4.920、-6.990,P<0.01)；lncRNA PCAT7-siRNA3组与空载组MDA-MB-436细胞S期细胞比例比较差异无统计学意义(t=0.083,P>0.05)。

A：lncRNA PCAT7-siRNA3组；B：空载组。

表1 lncRNA PCAT7-siRNA3组与空载组MDA-MB-436细胞周期分布比较

2.6 lncRNA PCAT7-siRNA3组与空载组MDA-MB-436细胞中p27蛋白相对表达量比较结果见图4。lncRNA PCAT7-siRNA3组和空载组MDA-MB-437细胞中p27蛋白相对表达量分别为0.98±0.04、0.54±0.13；lncRNA PCAT7-siRNA3组MDA-MB-436细胞中p27蛋白相对表达量显著高于空载组，差异有统计学意义(t=3.200，P<0.05)。

A：空载组；B：lncRNA PCAT7-siRNA3组。

3 讨论

女性乳腺癌的发病率逐年上升，成为威胁女性身心健康的主要问题之一[11]。TNBC的发病过程涉及癌基因过表达以及抑癌基因突变、缺失等，因缺乏有效的治疗靶点，目前TNBC的治疗以化学治疗为主，但仅20%～30%的TNBC患者对化学治疗敏感，导致TNBC患者的预后差于其他分型的乳腺癌患者[12]。因此，探索影响TNBC增殖、迁移和侵袭的相关机制有望为TNBC的治疗提供新思路。

研究发现，lncRNA在多种恶性肿瘤中异常表达，并参与恶性肿瘤的发生、发展[13]。lncRNA PCAT7位于染色体9q22.32，现已发现lncRNA PCAT7影响人体多种恶性肿瘤的进展[8-10]。相关研究显示，lncRNA PCAT7在鼻咽癌组织中的表达显著高于相对应的正常组织，且与不良预后有关，敲低lncRNA PCAT7可抑制鼻咽癌细胞的增殖能力[9]。另有研究发现，lncRNA PCAT7在非小细胞肺癌组织及细胞中高表达，下调lncRNA PCAT7的表达可抑制非小细胞肺癌细胞的迁移和侵袭[8]。ZHOU等[10]研究发现，下调lncRNA PCAT7可抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭。但目前关于lncRNA PCAT7在TNBC中的作用及机制尚未明确。

为研究lncRNA PCAT7对TNBC细胞生物学行为的影响，本研究将MDA-MB-436细胞分为lncRNA PCAT7-siRNA1组、lncRNA PCAT7-siRNA2组、lncRNA PCAT7-siRNA3组和空载组，分别转染lncRNA PCAT7-siRNA1、lncRNA PCAT7-siRNA2、lncRNA PCAT7-siRNA3和control siRNA，选择lncRNA PCAT7相对表达水平最低的lncRNA PCAT7-siRNA3组MDA-MB-436细胞用于后续实验，观察lncRNA PCAT7-siRNA3组和空载组MDA-MB-436细胞增殖能力、细胞周期分布、迁移能力和侵袭能力，探讨lncRNA PCAT7对TNBC MDA-MB-436细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响，研究显示，lncRNA PCAT7-siRNA3组lncRNA PCAT7 mRNA相对表达量低于空载组，提示lncRNA PCAT7-siRNA3组MDA-MB-436细胞中的lncRNA PCAT7被成功下调，可用于后续实验；克隆形成实验结果显示，lncRNA PCAT7-siRNA3组MDA-MB-436细胞的克隆形成数量显著低于空载组，说明下调lncRNA PCAT7表达可抑制TNBC MDA-MB-436细胞的增殖能力；进一步比较2组细胞周期分布发现，lncRNA PCAT7-siRNA3组G0/G1期细胞比例高于空载组，G2/M期细胞比例低于空载组，提示下调lncRNA PCAT7可能通过调控细胞周期分布而抑制TNBC细胞增殖能力；划痕实验结果显示，细胞划痕培养48 h后，lncRNA PCAT7-siRNA3组MDA-MB-436细胞的划痕愈合率显著低于空载组，说明下调lncRNA PCAT7表达可抑制MDA-MB-436细胞的迁移能力，提示lncRNA PCAT7可能参与了TNBC细胞的迁移过程；侵袭实验结果显示，lncRNA PCAT7-siRNA3组MDA-MB-436细胞的侵袭细胞数显著少于空载组，说明下调lncRNA PCAT7表达可抑制MDA-MB-436细胞的侵袭能力，提示lncRNA PCAT7可能参与了TNBC细胞的侵袭过程。

p27是细胞周期抑制蛋白Cip/Kip家族成员，通过与细胞周期蛋白CDK2结合抑制激酶活性，从而抑制细胞周期，发挥抑癌作用[14]。GU等[15]研究发现，lncRNA HCG11在骨肉瘤中低表达，并通过与miR-492-5p结合而上调p27的表达，从而抑制骨肉瘤生长。lncRNA TRMP可通过抑制p27调节细胞增殖及肿瘤异种移植增长[16]。本研究结果显示，lncRNA PCAT7-siRNA3组MDA-MB-436细胞中p27的相对表达水平显著高于空载组，推测下调lncRNA PCAT7对MDA-MB-436细胞增殖、迁移及侵袭能力的抑制作用可能与调控细胞周期抑制蛋白p27的表达有关。

综上所述，下调lncRNA PCAT7表达可显著抑制TNBC MDA-MB-436细胞的增殖、迁移和侵袭能力，其中抑制MDA-MB-436细胞增殖能力的机制可能与促进细胞周期抑制蛋白p27的表达有关，提示lncRNA PCAT7可能成为TNBC治疗的潜在靶点。