桂枝茯苓丸调控多囊卵巢综合征大鼠MMP-9/TIMP-1平衡的研究*

河北中医学院

李颢玥 王 茜 韩 雪 石 铖 郝 蕾(石家庄 050091)

提要 目的：研究桂枝茯苓丸对多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠血清及卵巢组织中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)及其抑制物基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)水平的影响。方法：60只SD雌性大鼠随机分为正常组、模型组、克罗米芬组、桂枝茯苓丸高、低剂量组；采用股骨内侧皮下注射胰岛素注射液和人绒毛膜促性腺激素(HCG)复制大鼠PCOS模型。连续治疗35 d后，测量体质量，收集血清、卵巢组织标本，采用酶联免疫法(ELISA)测定血清睾酮(T)、黄体生成素(LH)、卵泡成熟素(FSH)、MMP-9、TIMP-1的含量；光镜下观察卵巢组织的病理形态学变化；免疫组化法观察大鼠卵巢组织MMP-9、TIMP-1的表达情况。结果：与正常组相比，模型组体质量增加，血清T、LH、FSH、MMP-9水平升高，TIMP-1水平降低，卵巢可见窦腔明显扩大的囊性窦卵泡。与模型组相比，克罗米芬组、桂枝茯苓丸高、低剂量组体质量改善，血清T、LH、FSH、MMP-9水平均明显降低，TIMP-1水平升高，卵巢囊性窦卵泡减少，窦腔变小，各时期卵泡增多，黄体数目增多。结论：桂枝茯苓丸高、低剂量组均可明显改善PCOS大鼠症状，调控大鼠血清及卵巢组织中MMP-9、TIMP-1水平，且桂枝茯苓丸高剂量组疗效优于低剂量组。

多囊卵巢综合征(PCOS)是一种生殖功能障碍与糖代谢异常并存的内分泌紊乱综合征，以持续无排卵、雄激素过多和胰岛素抵抗(IR)为主要特征[1]，是育龄期妇女最常见的妇科内分泌疾病。研究发现PCOS在育龄期妇女中的发病率高达18%，且呈逐年升高的趋势[2]，严重影响女性的生殖健康。

PCOS在中医中属于“月经不调”“癥瘕”“不孕”等范畴[3]，病因错综复杂，中医认为本病与脾肾功能失调及痰湿、血瘀阻滞等密切相关[4]，其病机本质可能为肾虚引起的脾虚、肝郁及气血失调等[5]。桂枝茯苓丸首见于《金匮要略》，由桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、芍药组成，主妇人宿有瘕病，经断未及三月，而得漏下不止，胎动在脐上者，为瘕痼害[6]。方中桃仁、牡丹皮、白芍活血化瘀、养血和血，使瘀血去，新血生；桂枝温通血脉，助桃仁、牡丹皮活血之力；茯苓利水渗湿，寓有湿祛血止之用，五药合用共奏化瘀生新、调和气血之功[7-9]，与PCOS主要病机相符。

现代研究显示，基质金属蛋白酶(MMPs)以及特异性组织抑制物(TIMPs)对排卵有重要的生理作用，可以通过调节卵巢内细胞外基质(ECM)成分的降解和重建，参与PCOS排卵障碍的病理过程[10-12]。为了进一步阐明桂枝茯苓丸的作用机制，本实验通过测定PCOS模型大鼠体质量、血清及卵巢组织中血清睾酮(T)、黄体生成素(LH)、卵泡成熟素(FSH)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)在治疗前后的变化，探索其对PCOS的影响，为继承发展桂枝茯苓丸的临床应用提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 实验动物 60只成年SD大鼠，清洁级，雌性，体质量180～200 g，由河北医科大学动物实验中心提供。许可证号：SCXK(冀)2018-004。实验室内通风良好，温度保持在20 ℃～25 ℃。本研究获得河北中医学院动物伦理委员会的批准。

1.2 实验药物 胰岛素注射液(购于江苏万邦生化医药股份有限公司，国药准字H10890001)、0.9%氯化钠注射液(购于石家庄四药有限公司，国药准字H13023200)、人绒毛膜促性腺激素(HCG，购于丽珠集团丽珠制药厂，2 000 U/瓶，国药准字H44020674)、葡萄糖(Vetec reagent grade，规格：500 g/瓶， Lot：WXBC2393V)、桂枝茯苓丸(购于江苏康缘药业股份有限公司，规格：0.31 g/粒，国药准字Z10950005)、克罗米芬片(购于高特制药有限公司P.O. Box51785Limassol，塞浦路斯，规格：50 mg/片，《进口药品注册证》证号：H20140688)。

1.3 实验试剂与仪器 大鼠T、LH、FSH的ELISA试剂盒均购于德国IBL公司(批号20161130)；MMP-9、TIMP-1兔单克隆抗体均购于英国Abcam公司(批号分别为GR426511-4和GR238752-1)；MMP-9、TIMP-1单克隆抗体，SP-KITT9000试剂盒均购于美国ZYMED公司；防脱片剂APES、显色剂DAB均购于北京中山生物技术有限公司。BX43F型显微镜[奥林巴斯(中国)有限公司]，H17502型冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)，Versa MaxTM多功能酶标仪(美国Molecular Devices)。

1.4 造模、分组及给药

1.4.1 模型制备：采用股骨内侧皮下注射胰岛素注射液(初始浓度为0.5 U/d，后每天递增0.5 U，直至6.0 U/d不变)和HCG(1.5 U/d)复制PCOS模型，共注射21 d。造模期间，为防止低血糖发生，以5%葡萄糖溶液代替日常饮水。

1.4.2 分组给药：将60只大鼠随机分为正常组、模型组、克罗米芬组、桂枝茯苓丸高剂量组、桂枝茯苓丸低剂量组，每组12只。除正常组外，其他大鼠造模成功后，克罗米芬组给予相当于生药0.21 g/kg·d-1灌胃，桂枝茯苓丸高剂量组给予相当于生药2.33 g/kg·d-1灌胃，桂枝茯苓丸低剂量组给予相当于生药1.16 g/kg·d-1灌胃，各组连续用药35 d。正常组与模型组给予同体积生理盐水灌胃。所有大鼠每周称量体质量1次。

1.5 标本采集 末次给药后，对所有大鼠禁食禁水24 h，腹腔注射10 %水合氯醛麻醉，自腹主动脉取血，将血样在4 ℃下以3 000 r/min离心5 min，分离血清；取血后，将大鼠以颈椎脱臼处死，剖腹取出并迅速分离大鼠两侧卵巢，取相同侧卵巢对切，置于浓度为4 %的福尔马林液中固定、石蜡包埋，切片。

1.6 指标检测 将卵巢组织的石蜡切片进行HE染色，在光镜下观察卵巢的病理变化情况。采用酶联免疫法(ELISA)检测大鼠血清T、LH、FSH、MMP-9、TIMP-1含量，并计算MMP-9/TIMP-1比值。用免疫组化法检测大鼠卵巢组织中MMP-9、TIMP-1的表达，用显微镜的Optimas数字彩色图像显微系统(optimas 6.51,美国)进行病理图像分析，计算各区域平均灰度值。平均灰度值越高，表明阳性表达越弱，平均灰度值越低，表明阳性表达越强[13]。

2 结果

2.1 各组大鼠体质量变化情况 与正常组相比，模型组大鼠体质量增长值升高(P<0.01)，说明PCOS大鼠模型复制成功。与模型组相比，克罗米芬组、桂枝茯苓丸高、低剂量组大鼠体质量增长值均明显降低(P<0.05或P<0.01)。说明用药后PCOS大鼠肥胖症状有了改善。详见表1。

表1 各组大鼠体质量变化情况

2.2 各组大鼠卵巢组织形态学情况变化 正常组大鼠卵巢在光镜下可见黄体和发育于各时期的卵泡，卵泡的组织结构清晰，卵泡壁由8～9层形状完整、排列整齐的颗粒细胞组成，卵泡膜细胞呈现梭状排列，可见卵细胞、透明带以及放射冠结构，膜-间质细胞无增生现象，无囊性窦卵泡的出现。与正常组相比，模型组大鼠卵巢可见窦腔明显扩大的囊性窦卵泡，颗粒细胞层数明显减少，卵母细胞及放射冠消失，黄体组织数目明显减少甚至消失，并有不完全的黄素化，膜细胞明显增生。与模型组相比，克罗米芬组、桂枝茯苓丸高、低剂量组大鼠卵巢囊性窦卵泡数量减少，窦腔变小，颗粒细胞层数增加，黄体数目增加。其中，桂枝茯苓丸高剂量组大鼠颗粒细胞及黄体数目的改善情况明显好于低剂量组。各组大鼠卵巢组织形态学变化见图1。

注：1.正常组；2.模型组；3.克罗米芬组；4.桂枝茯苓丸低剂量组；5.桂枝茯苓丸高剂量组。(图2、图3同)图1 各组大鼠卵巢组织形态学变化(HE，×100)

2.3 各组大鼠血清中T、LH、FSH水平情况比较 与正常组相比，模型组大鼠血清T值和LH值均明显升高(P<0.01)，说明PCOS大鼠模型复制成功。与模型组相比，克罗米芬组、桂枝茯苓丸高、低剂量组大鼠血清T值、LH值及FSH值均明显降低(P<0.05或P<0.01)。说明用药后PCOS大鼠血清T值、LH值及FSH值升高的症状有了改善。详见表2。

表2 各组大鼠血清中T、LH及FSH水平的变化情况

2.4 桂枝茯苓丸对PCOS大鼠血清MMP-9、TIMP-1水平的影响 与正常组比较，模型组大鼠血清MMP-9水平升高，TIMP-1水平降低，MMP-9/TIMP-1比值升高(P<0.01)；与模型组比较，克罗米芬组、桂枝茯苓丸高、低剂量组大鼠血清MMP-9水平降低，TIMP-1水平升高，MMP-9/TIMP-1比值降低。详见表3。

表3 各组大鼠血清MMP-9、TIMP-1水平及MMP-9/TIMP-1比值变化

2.5 桂枝茯苓丸对PCOS大鼠卵巢组织MMP-9、TIMP-1表达的影响 各组卵巢中卵泡的颗粒细胞和发育良好的卵泡膜间质细胞中均可检测到MMP-9和TIMP-1的杂交信号。与正常组相比，模型组卵泡颗粒细胞和卵泡膜细胞中MMP-9的灰度值均下降，TIMP-1的灰度值均升高，差异具有显著性(P<0.01或P<0.05)；与模型组相比，克罗米芬组、桂枝茯苓丸高、低剂量组卵泡颗粒细胞及卵泡膜细胞中MMP-9的灰度值均升高，TIMP-1的灰度值均降低，差异具有显著性(P<0.01或P<0.05)。详见表4、图2、图3。

表4 各组大鼠卵巢局部MMP-9、TIMP-1阳性细胞平均灰度的比较

图2 免疫组化法观察各组大鼠卵巢组织中MMP-9的表达(免疫组化，×100)

图3 免疫组化法观察各组大鼠卵巢组织中TIMP-1的表达(免疫组化，×100)

3 讨论

PCOS临床表现为持续性的无排卵、胰岛素抵抗和高雄激素，是现代常见的妇科生殖障碍性疾病之一，也是导致女性不孕的主要因素之一，严重影响了女性的身心健康[14-15]。研究发现，PCOS的发病机制可能与肾上腺功能紊乱、下丘脑-垂体-卵巢轴功能失常和反馈异常等有关[16]，垂体分泌和释放FSH、LH的功能紊乱，会进一步导致FSH的促卵泡成熟和排出的功能障碍以及LH诱导的排卵障碍[17-18]。而FSH介导的芳香化酶受到抑制，则使T水平持续升高，性激素水平紊乱加剧。因此，T、LH、FSH可能为影响PCOS大鼠发情周期的重要指标[19]，其主要变化趋势为PCOS的发病会导致性激素T、LH、FSH水平的升高[20]。PCOS在中医学属“月经不调”“不孕”等范畴，临床研究表明，桂枝茯苓丸在治疗PCOS方面有明显优势[21]。

本实验采用给大鼠股骨内侧皮下注射胰岛素和HCG的方法进行PCOS造模，主要依据是胰岛素能刺激卵巢卵细胞膜和间质细胞合成雄激素，降低血中性激素结合蛋白，使卵巢雄激素浓度增加，导致卵泡闭锁，形成多囊[22]。克罗米芬为人工合成的非甾体制剂，具有较强的抗雌激素效应和较弱的雌激素作用，临床常用于治疗PCOS等无排卵的女性不孕症，因此本实验选取其为阳性对照药物。结果显示，造模后大鼠体质量明显增加，血清中T、LH水平均明显升高，卵巢可见窦腔明显扩大的囊性窦卵泡，表明造模成功。与模型组比较，桂枝茯苓丸高、低剂量组大鼠血清T、LH、FSH水平均明显降低，卵巢囊性窦卵泡数量减少，窦腔变小，颗粒细胞层数增加，黄体数目增多；其中桂枝茯苓丸高剂量组较低剂量组血清水平变化更为明显，卵巢中也可见4～6层形状完整、排列较紧凑的颗粒细胞，黄体数目多于低剂量组。

MMPs是LH依赖的调节卵泡破裂和早期黄体形成的重要因子之一[23]，而TIMPs的表达也有助于调节卵泡破裂和向黄体转化，且二者均定位于卵泡的颗粒细胞、膜细胞及基质细胞上[24]，受激素、生长因子和细胞因子的调控[25-26]，通过调节卵巢动态结构成分的周期性变化，对卵泡和黄体功能发挥着极为重要的作用，在排卵和黄体形成过程中相互作用共同协调。在正常的排卵过程中，卵泡的发育成熟、排卵以及黄体的形成和退化都依赖于细胞外基质(ECM)周期性的有序降解和组织重建，MMPs/TIMPs蛋白水解酶家族的精确调控在ECM重塑过程中起着非常重要的作用[27]。MMP-9通过降解基质膜的主要成分参与排卵和卵泡的生长，是分解ECM的关键因子[28]，而TIMP-1则对MMP-9有抑制作用，因此MMP-9/TIMP-1比例正常对于维持黄体细胞所依赖的ECM微环境极为重要。

实验结果显示，PCOS模型大鼠卵巢组织颗粒细胞和卵泡膜细胞中存在MMP-9的异常高表达，TIMP-1异常低表达，提示PCOS有明显增高的溶解明胶的活性，这可能与多个卵泡发育和囊肿形成时卵巢ECM重塑的增加有关，增高的MMP-9使卵巢ECM降解异常，从而使多囊卵泡形成，逐渐发展为慢性无排卵。模型组大鼠血清中MMP-9/TIMP-1比值高于正常组，说明MMP-9/TIMP-1的平衡向蛋白酶活性增强方向移动，可能因为PCOS较厚的卵巢皮质需要更多的蛋白酶进行水解，TIMP-1的降低是对卵巢被膜增厚的一种代偿机制。MMP-9/TIMP-1比值升高可能与PCOS的排卵障碍有关。桂枝茯苓丸能降低MMP-9的异常高表达，升高TIMP-1的异常低表达，降低MMP-9/TIMP-1比值，推测其可能通过抑制LH的分泌，阻断外周靶器官雄激素的作用，使卵巢ECM降解恢复正常，通过正反馈激发排卵。

综上所述，桂枝茯苓丸能调节PCOS大鼠血清激素水平，改善组织结构，达到治疗效果，且高剂量组疗效优于低剂量组。桂枝茯苓丸治疗PCOS的机制，可能与抑制胶原增生、减少胶原沉积、增加胶原降解、促进正常组织细胞增殖有关。