基于“既病防变”理论研究消溃汤调控IL-6/STAT3信号通路抑制溃疡性结肠炎癌变的作用机制*

王芳增，卢玉阳，杨会举，刘佃温

(1.濮阳市第三人民医院，河南 濮阳 457000；2.河南中医药大学针灸推拿学院，河南 郑州 450046；3.河南中医药大学第三附属医院肛肠科，河南 郑州 450008)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种病因复杂、机制不明、以结直肠反复炎症性病变为主的疾病[1]。其临床表现以腹泻、腹痛、黏液脓血便为主，肠外症状为辅，反复发作，病程迁延，伴有癌变的风险[2-3]。溃疡性结肠炎发病率有逐年增高的趋势，在溃疡性结肠炎中结肠癌的发病率为3%～5%。随着患病时间的延长，发生结肠癌的危险性也逐年增加，≥10年者的发生率是普通人的10倍以上[4]。《素问·四气调神大论篇》曰：“圣人不治已病治未病，不治已乱治未乱。”意即未病先防与既病防变：在未患病时采取有效措施，扶助正气，去除病因，使疾病不能显现；患病之后，采取有效措施进行早期诊断和治疗，截断疾病的发展和传变，并阻止疾病预后复发，巩固疗效[5]。消溃汤是刘佃温教授自拟方。本课题组经过长期临床观察发现，消溃汤治疗UC疗效确切，能明显改善患者临床症状；同时前期研究[6]表明，消溃汤能阻断大鼠UC病程进展，修复受损黏膜，改善症状。方中白头翁入大肠经，清热解毒，凉血止痢，为君药。白及收敛止血，消肿生肌，为臣药。佐以石榴皮、五倍子涩肠止泻，收敛止血；黄连、苦参清大肠之湿热，祛大肠之浊毒。白蒺藜活血祛风使大肠得以濡养，为使药。全方共奏清热解毒渗湿、涩肠止血之效。本研究通过建立大鼠UC模型，基于“既病防变”理论观察消溃汤对于白细胞介素(IL)-6/转录激活因子(STAT3)信号通路的调控作用，探究其抑制溃疡性结肠炎癌变的相关机制，旨在为UC的临床治疗提供相关理论依据。

1 材料与方法

1.1 动 物

4～5周龄SD大鼠60只，雄性，体质量(200±20)g，由河南省实验动物中心提供，实验动物生产许可证编号为SCXK(豫)2017-0001，动物质量合格证号41003100001868。饲养于河南中医药大学动物实验中心，实验室使用许可证编号SYXK(豫)2010-0001。环境相对湿度40%～60%，室温20～22 ℃，每日光照12 h。饲养在塑料笼内，每笼大鼠不多于3只，自由饮水、摄食，常规饲养7 d以适应环境。

1.2 药品、试剂与仪器

消溃汤药物组成：白头翁20 g，石榴皮15 g，白及20 g，五倍子15 g，白蒺藜10 g，黄连15 g，苦参15 g。药材由河南中医药大学第三附属医院中药房提供。参照徐叔云教授主编的《中药药理实验方法学》大鼠和人之间按照体表面积折算出来的等效剂量比值换算，动物实验中的治疗组按成人剂量的7倍为有效剂量。成人体质量以60 kg计算，临床用药量为110 g/d，给药剂量为1.83 g/kg；大鼠给药量为10倍计算，即给药剂量为18.3 g/kg。煎煮方法：先将以上药物置于干净的玻璃杯中，加入蒸馏水500 mL浸泡 2 h；于100 ℃煎煮30 min，过滤药渣得滤液约300 mL；将药渣再加入蒸馏水400 mL，同法煎煮，得滤液约300 mL；合并两次滤液浓缩成60 mL(生药含量1.83 g/mL)，置4 °C冰箱保存，备用。美沙拉嗪缓释颗粒剂，爱的发制药公司产品，注册证号H20100063，0.5 g/袋，用生理盐水配制成0.1 g/mL的混悬液，于4 ℃冰箱中备用。以成人每天4 g临床用药量、体质量60 kg计，用药剂量为0.07 g/kg；大鼠给药剂量按成人临床用量的10倍计算，即0.7g/kg体质量。Trizol，赛默飞世尔公司产品，批号15596-026；HiScript Reverse Transcriptase(RNaseH)、5×HiScript Buffer、50×ROX Reference Dye2、SYBR Green Master Mix，均为诺唯赞公司产品，批号为101-01/02、101-01/02、111-02、111-02；ddH2O(DNase/RNase Free)，复能基因公司产品，批号C1D230A；Ribonuclease Inhibitor，北京全式金公司产品，批号LOT#J11202；dNTP，天根生化科技公司产品，批号LOT#P4325；Taq Plus DNA Polymerase和DL2000 DNA Marker，均为天根生化科技公司产品，批号T105-01、MD114-02；Random Primer(N6)，北京艾德莱生物科技公司产品，批号271830AH；三硝基苯磺酸，西格玛奥德里奇公司产品，批号P2297；大鼠IL-6 ELISA试剂盒、大鼠IL-10 ELISA试剂盒，均为武汉基因美生物科技公司产品，批号13314128222、13814124222。E200型光学显微镜，日本尼康公司产品；QuantStudio6实时荧光定量PCR仪，美国应用生物系统公司产品；Nano-100型微量分光光度计，杭州奥盛仪器有限公司产品；EDC-810型PCR仪，东胜创新生物科技有限公司产品；JY02S型紫外分析仪，北京君意东方电泳设备有限公司产品；KD-BMII型石蜡切片机，德国徕卡产品；H1650-W离心机，德国艾本德公司产品。

1.3 模型的建立与分组

随机选取15只大鼠作为正常组，不予造模；将剩余45只大鼠采用TNBS灌肠方法制备UC模型[7]。造模后每日观察记录大鼠饮食、体质量、活动量等一般情况，详细记录其大便性状及肛周污物情况。参照参考文献[8]，拟定UC模型大鼠诊断标准：①便溏或伴有脓血；②体质量下降，食欲不振；③精神萎靡，毛发枯萎；④弓背、活动减少；⑤肠黏膜组织病理学检查见黏膜层及黏膜下层炎症浸润、溃疡形成。具备上述条件则表明造模成功。造模期间死亡4只，考虑死因为药物毒性不耐受。7 d后造模结束，将宏观症状不符合标准的2只排除[9]。在余下39只中随机取3只处死，解剖结肠组织确定造模成功。将剩余的36只大鼠随机分为模型组、消溃汤组、美沙拉嗪组3组，每组12只。

1.4 给药方法

造模成功 24 h 后开始给药。消溃汤组给予消溃汤煎剂18.3 g/kg体质量，美沙拉嗪组给予美沙拉嗪混悬液0.7 g/kg体质量，模型组及正常组灌胃生理盐水，灌胃容积均为2 mL，1次/d，持续14 d。

1.5 检测指标

1.5.1 样本采集

末次给药后24 h，以100 g/L水合氯醛按3 μL/g体质量行腹腔注射麻醉，取材。①腹主动脉采血5 mL，于肝素抗凝管中静置5 min，以离心半径13.5 cm、转速3 000 r/min 离心15 min，取血清置入EP管，冻存-80 ℃冰箱，用于ELISA检测IL-10、IL-6。②采血后,取肛门以上2～12 cm肠段，4 ℃生理盐水清洗，滤纸吸干；剪开肠管，肉眼观察肠黏膜并记录结果。此外，取一块约1 cm病变结肠，40 g/L多聚甲醛固定，脱水、透明后石蜡包埋，制成4 μm切片，显微镜下观察组织学变化。③取1 g新鲜结肠组织于-80 ℃冰箱中冰冻保存，用于实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)测定IL-6 mRNA、Janus激酶2(JAK2)mRNA、STAT3 mRNA和缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)mRNA相对表达量。

1.5.2 一般情况

每天灌胃前观察大鼠的活动、饮食饮水、毛发光泽、精神状态。

1.5.3 疾病活动指数(DAI)评分

给药的第1、14天称量体质量，观察大便性状，检测潜血情况，进行DAI评分[10]。计分标准：体质量无下降、下降1%～15%、下降>15%各计0、2、4分；大便正常、半稀便、稀便各计0、2、4分；大便潜血阴性、潜血阳性、肉眼血便各计0、2、4分。DAI评分=体质量下降评分+大便性状评分+便血评分

1.5.4 结肠黏膜损伤指数(CMDI)评分

取整个结肠组织，剪开标本、冲洗大便，肠黏膜层向上展开，平铺在滤纸上，用大头针两端固定，浸没在生理盐水中，肉眼观察黏膜损伤程度。按以下标准[11]进行评分。无损伤，计0分；局部充血、水肿但未出现溃疡，计1分；有溃疡，但没有明显炎症，计2分；有溃疡，仅有一处出现炎症，计3分；有多处溃疡和炎症，溃疡大小l cm，计5分。

1.5.5 结肠组织损伤指数(TDI)评分

采用苏木素-伊红(HE)染色法观察大鼠结肠组织病理变化。取石蜡切片，60 ℃烤片2h，常规脱蜡、水化，置于苏木素染液内，盐酸乙醇进行分化，流水冲洗，采用伊红染液处理2 min复染，蒸馏水冲洗充分去除染液，脱水，透明，封片，光学显微镜下观察并拍照。采用以下标准[12]进行相关评分：正常黏膜，计0分；基底隐窝缺损1/3，计1分；基底隐窝缺损2/3，计2分；隐窝缺失，仅余表面上皮，伴炎细胞浸润，计3分；黏膜糜烂、溃疡伴大量炎细胞浸润，计4分。

1.5.6 血清IL-10、IL-6水平

按照试剂盒说明书检测。

1.5.7 结肠IL-6、JAK2、STAT3、HIF-1α mRNA水平

采用Trizol法提取RNA，将干燥RNA沉淀溶于20 μL DEPC水中。利用分光光度计检验RNA纯度及浓度是否合格。将总RNA放于-80 ℃冰箱内保存以备用。

①反转录。反应体系总体积20 μL：2 μL RNA，1 μL Oligo(dT)Primer，4 μL dNTP，4 μL 5×Hiscript Buffer，1 μL Hiscript Reverse Transcriptase，0.5 μL Ribonuclease Inhibitor，用无核糖核酸酶的去离子水补足至20 μL。反应条件设置为：25 ℃反应5 min，50 ℃反应15 min，85 ℃反应5 min，4 ℃反应10 min。

定量PCR。反应体系总体积20 mL,其中4 μL cDNA(已稀释3倍)，0.4 μL的Forward Primer(10 μmol/L)和0.4 μL Reverse Primer(10 μmol/L)，10 μL SYBR Green Master Mix，0.4 μL 50×ROX Reference Dye 2，4.8 μL ddH2O(Rnasefree)。反应条件设置为：50 ℃ 2 min，95 ℃10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40 个循环。运用2-△△CT法计算相对表达量。引物由北京博迈德生物技术有限公司合成。引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.6 统计学分析

2 结 果

2.1 各组大鼠一般情况对比

正常组：从实验开始到结束，大鼠体质量稳步増长，精神状况良好，毛发光亮，进食水量正常，敏捷活泼，无便血及黏液，无腹泻及黏液脓血便，无死亡。模型组：造模开始当天即出现腹泻；后逐渐出现黏液脓血便、毛发欠光泽、活动度减少、进食量减少、体质量下降等表现，肛门周围沾有污物；2周后大鼠大便次数进一步增多，多呈黏液脓血便，大鼠肛周污物呈暗红色。灌胃期间大鼠无死亡。消溃汤组、美沙拉嗪组：造模后表现同模型组。灌胃给药2周后，大便逐渐正常，精神好转，活动量増多，毛发逐渐光泽，大便成形、无黏液脓血、无恶臭，肛周变清洁，饮水量增加，体质量回升。

2.2 各组大鼠DAI评分对比

给药第1天，与正常组对比，模型组、消溃汤组和美沙拉嗪组DAI评分增高，差异有统计学意义(P<0.05)。给药第14天，与模型组对比，消溃汤组和美沙拉嗪组的DAI评分均下降，差异有统计学意义(P<0.05)；消溃汤组和美沙拉嗪组之间DAI评分对比，差异无统计学意义(P>0.05)；与正常组对比，其余3组的DAI评分仍然偏高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠DAI评分对比 分，

2.3 各组大鼠结肠组织病理学形态、CMDI评分 和TDI评分对比

正常组：大鼠结肠黏膜组织表面光滑完整，未见充血，溃疡形成；光镜下腺体分布规则，可见少量炎性细胞浸润。模型组：大鼠结肠黏膜表面充血水肿，伴坏死及溃疡形成，达结肠肌层；光镜下可见大量炎性细胞浸润，肌层结构紊乱，杯状细胞减少，隐窝脓肿形成，黏膜损伤指数显著增高。消溃汤组和美沙拉嗪组：结肠黏膜表面溃疡基本愈合，伴有散在黏膜糜烂点；光镜下可见中等量炎性细胞浸润，肌层结构较清晰，损伤指数较模型对照组均显著降低。见图1。

与正常组对比，模型组CMDI评分、TDI评分均增高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组对比，消溃汤组和美沙拉嗪组的CMDI评分、TDI评分均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。消溃汤组和美沙拉嗪组之间2个指标对比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠CMDI评分、TDI对比 分，

2.4 各组大鼠血清IL-6、IL-10水平对比

与正常组对比，模型组大鼠血清IL-6升高、IL-10降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组对比,消溃汤组和美沙拉嗪组IL-6降低、IL-10增高，差异有统计学意义(P<0.05)。消溃汤组和美沙拉嗪组之间2个指标对比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 各组大鼠血清IL-6、IL-10水平对比

2.5 各组大鼠结肠组织IL-6、JAK2、STAT3、HIF-1α mRNA水平对比

与正常组对比，模型组、美沙拉嗪组和消溃汤组大鼠结肠组织中IL-6、JAK2、STAT3、HIF-1α mRNA均升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组对比，消溃汤组和美沙拉嗪组大鼠结肠组织中的IL-6、JAK2、STAT3、HIF-1α mRNA均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。消溃汤组和美沙拉嗪组之间各指标对比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 各组大鼠结肠组织IL-6 mRNA、JAK2 mRNA、STAT3 mRNA、HIF-1α mRNA水平对比

3 讨 论

近年来UC发病率逐年增高，随着病程的延长结肠癌变的风险明显增加[13]。UC是由多种因素引起的，包括遗传易感性、环境因素、吸烟、饮食因素、肠道微生物群和免疫系统功能的变化[14]。UC属中医学“肠澼”“痢疾”“肠风”等范畴。浊毒是该病发生发展的关键，是UC的病程进展中病因和病理的统一。UC病因初为湿盛，湿盛化浊，浊久为痰，湿、浊、痰三者郁久化热，热之极为毒，终而形成浊毒[15]。其壅滞脏腑阻碍传化糟粕的功能，壅滞经络损伤大肠脂膜血络，导致局部气血郁结，日久化热，瘀血化为脓血。消溃汤由白头翁、白及、石榴皮、五倍子、白蒺藜、黄连、苦参组成，具有清热解毒、化浊收敛的功效。现代药理学研究证明，其组方中各单味药材具有抗炎、抗肿瘤作用[16-20]。本研究证实了消溃汤治疗UC的有效性。结果表明，消溃汤具有抑制炎症反应、改善肠道功能及恢复肠道生理结构的作用。

以往研究[21-22]发现：炎症或感染部位是结肠癌等肿瘤的高发部位，细胞突变概率的增加与炎症环境相关；炎症可通过破坏机体免疫，进而减弱相关疗法对癌症的治疗作用。研究[23-24]表明：促炎症细胞因子IL-6能通过STAT3信号通路诱导相关基因的表达，进而调控细胞增殖和凋亡，参与机体炎症反应；同时，一定程度阻断该通路能够对癌细胞的增殖和转移发挥抑制作用，此种效应可能通过阻断通路传导进而调控下游相关基因表达实现。实验[25]证明，抗炎药物能降低各种癌症的发生风险，长期使用可有效降低结肠癌发生风险、死亡风险，减小肿瘤体积。由此可推断，炎症反应对肿瘤的发展有一定的促进作用。

生理状态下，结肠黏膜的损伤与修复处于动态平衡之中。当黏膜的防御和修复能力低于损伤因素或炎症攻击时，机体动态平衡被打破，病理状态发生。IL-6是多效性细胞因子，在所有炎症性疾病及癌症的病理过程中发挥着重要作用[26]。研究表明，其可激活细胞内JAK2/STAT3信号传导产生联级反应，使炎症呈瀑布样爆发。IL-6与靶细胞表面的同源受体IL-6R识别并结合，进一步活化细胞膜表面糖蛋白130，进而激活JAK2，使受体酪氨酸激酶活化，并与STAT3蛋白结合，STAT3磷酸化形成二聚体，以此种形式转运进入细胞核中以诱导受STAT3调控的基因表达，进一步产生IL-6因子，以及调控下游蛋白而加重炎症反应[27-29]。HIF-1α是转录激活因子，对于肠道黏膜细胞的营养吸收、肠道屏障功能、先天性和适应性免疫反应至关重要[30]。于传宗等[31]发现，野生蒙古口蘑多糖通过抑制JAK-STAT3和HIF-1α信号通路发挥抗炎作用，此进一步明确了HIF-1α参与了溃疡性结肠炎的发生机制。

本研究结果显示，消溃汤组的血清IL-6水平较模型组降低，IL-10水平升高，表明消溃汤能抑制IL-6分泌并促进IL-10的分泌，间接证明消溃汤能提高大鼠机体内单核细胞和巨噬细胞的功能，减少致炎因子的释放。炎症介质可分为促炎介质和抑炎介质两类，两者的平衡关系被打破就会导致严重的炎症反应[32]。本研究证明消溃汤对促炎介质有抑制作用，对抑炎介质有一定的促进作用，调控相关因子可能是消溃汤发挥其治疗作用的机制之一，但消溃汤是由多种药物配伍而成，其作用机制有待进一步深入研究。

实验结果表明，IL-6、JAK2、STAT3、HIF-1α与溃疡性结肠炎具有相关性；消溃汤通过抑制IL-6、JAK2、STAT3基因的表达，从而减轻肠道炎症反应，在治疗UC中其机理可能通过抑制IL-6/JAK2/STAT3信号通路来完成。消溃汤能有效抑制致炎因子IL-6的释放，降低JAK2/STAT3通路的过度磷酸化，引起下游基因HIF-1α转录翻译水平的降低，削弱炎症联级反应。相关研究证实多种肿瘤的发生、进展、侵袭和转移与JAK/STAT信号通路过度激活密切相关，病理状态下HIF-1α过度激活会加剧肠道组织学和超微结构的改变，导致肠道损伤、炎症和结肠直肠癌的发生[33-34]。本研究表明，消溃汤是通过一系列联级反应对溃疡创面进行治疗使之恢复，并且对炎症性肠病的癌变起到抑制作用。

综上所述，消溃汤治疗UC大鼠作用机制通过调节IL-6/JAK2/STAT3/HIF-1α轴，降低血清IL-6水平和抑制病变组织IL-6 mRNA表达，从而降低JAK2 mRNA表达，减少STAT3磷酸化，引起STAT3 mRNA表达量降低，并通过HIF-1α靶点抑制其基因表达，最终起到抗溃疡性结肠炎作用，且能抑制其癌变。通过提取中药有效成分针对IL-6/JAK2/STAT3/HIF-1α轴中相关蛋白和酶为靶点用于治疗UC可能会成为未来研究的方向。然而JAK/STAT信号通路和其他信号通路之间的协同作用还没有很好的解释，尚需要进一步研究。