miR-323a-3p通过靶向结合TM4SF1而调控NSCLC A549细胞的增殖、迁移和侵袭

金曼，王彤辉，任小飞，李淼（青海省第五人民医院 肿瘤内科，青海 西宁 810000）

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，是全世界癌症相关死亡的主要癌种之一[1‑2]。对于早期患者来说，最有效的治疗方法是手术切除，但是手术后的复发率很高，晚期肺癌患者的生存期较短[3]。NSCLC是最常见的肺癌形式，约占所有病例的80%～85%[4]。研究[5]表明，miRNA在肺癌的进程中具有至关重要的作用，可能成为肿瘤的生物标志物或治疗靶点。资料[6]显示，miR‑323a‑3p 在骨肉瘤组织和细胞中被下调，miR‑323a‑3p 具有诱导骨肉瘤细胞凋亡和抗增殖的作用。miR‑323a‑3p在膀胱癌组织和细胞中表达下调，过表达miR‑323a‑3p抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭[7]。然而miR‑323a‑3p 在NSCLC 发展进程中的功能和机制尚未阐明。本研究采用生物信息学方法预测到四次穿膜蛋白超家族成员1（transmembrane 4 super family number 1，TM4SF1）是miR‑323a‑3p 的潜在靶标之一，TM4SF1 被报道在NSCLC组织和细胞中表达上调，可促进NSCLC 细胞的增殖、迁移和侵袭，抑制细胞凋亡[8]。基于此，本研究的目的是阐明miR‑323a‑3p 在NSCLC组织中的表达水平及其与A549细胞增殖、迁移、侵袭的关系及潜在的分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

NSCLC细胞A549购自美国ATCC公司，54只清洁级雌性BALB/c 裸鼠购自北京华阜康公司[许可证号：SCXK（京）2019‑0008]，DMEM 培养基购自美国Gibco 公司，miR‑323a‑3p mimic/inhibitor 及各自阴性对照miR‑NC、anti‑miR‑NC 和TM4SF1 小干扰RNA（si‑TM4SF1）、小干扰RNA 阴性对 照（si‑NC）、TM4SF1过表达质粒（pcDNA‑TM4SF1）、过表达阴性对照质粒pcDNA 均购自广州RiboBio 公司，GAPDH兔单克隆抗体购自Beyotime 生物技术研究所，细胞周期蛋白D1（cyclin D1）兔单克隆抗体、p21兔单克隆抗体、MMP‑2 兔单克隆抗体、MMP‑9 兔单克隆抗体均购自美国Abcam 公司，TM4SF1 兔多克隆抗体、辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔二抗均购自美国Santa Cruz 公 司，MTT 购 自Sigma‑Aldrich 公 司，TaqMan PCR 检测试剂盒购自北京天根生化公司，LipofectamineTM2000试剂购自美国Invitrogen公司。

本研究在2014 年1 月至2014 年12 月之间，共纳入于青海省第五人民医院就诊的20例NSCLC患者，手术过程中收集癌组织和匹配的癌旁组织标本（距离肿瘤边缘大于3 cm），均由病理学专家确认后保存在-80 ℃冰箱中。研究设计与程序得到本医院伦理委员会的批准（审批编号：201311‑20），获取患者的知情同意并签署知情同意书。组织标本用于qPCR 和WB法检测。

1.2 qPCR 检测NSCLC 组织与细胞中miR‑323a‑3p和TM4SF1 mRNA的表达

使用TRIzol 试剂提取总RNA，包括NSCLC 组织、癌旁组织和细胞A549，通过NanoDrop 2000 分光光度计测量RNA 浓度。然后按照制造商设定的规程，使用反转录试剂盒进行反转录、TaqMan PCR 检测试剂盒进行PCR。将U48 和GAPDH 用作内源对照，以2‑ΔΔCT方法分析miR‑323a‑3p 和TM4SF1 mRNA的表达水平。U48 正向引物为5'‑TGACCCCAG GTAACTCTGAGTGTGT‑3'，反向引物为5'‑AAC TCAAGGTTCTTCCAGTCACG‑3'；GAPDH 正向引物为5'‑GGAGTCAACGGATTTGGT‑3'，反向引物为5'‑GTGATGGGATTTCCATTGAT‑3'；miR‑323a‑3p 正向引物为5'‑CACATTACACGGTCGACCT‑3'，反 向引物为5'‑AACTCAAGGTTCTTCCAGTCACG‑3'；TM4SF1 正向引物为5'‑GGTTCTTTTCTGGCATCG TAGGAGGTG‑3'，反向引物为5'‑CTGGCCGAGGGA ATCAAGACATAGTG‑3'。

1.3 细胞培养与转染分组

A549 细胞用DMEM 培养基于37 ℃、5%CO2的培养箱内培养。A549 细胞转染时，以1×105个/孔的密度接种于6 孔板，将细胞分为miR‑NC组（转染miR‑NC）、miR‑323a‑3p 组（转染 miR‑323a‑3p mimic）、anti‑miR‑323a‑3p 组（转染miR‑323a‑3p inhibitor）、anti‑miR‑NC 组（转染anti‑miR‑NC）、si‑NC组（转染si‑NC）、si‑TM4SF1 组（转染si‑TM4SF1）、miR‑323a‑3p+pcDNA 组（共转染miR‑323a‑3p mimic和pcDNA）、miR‑323a‑3p+pcDNA‑TM4SF1 组（共转染miR‑323a‑3p mimic 和pcDNA‑TM4SF1）。每组设3 平行孔。培养细胞至60% 汇合时，使用LipofectamineTM2000试剂进行转染，转染时间为48 h。

1.4 MTT 法检测调控miR‑323a‑3p 与TM4SF1 基因的表达对A549细胞增殖能力的影响

将转染后A549 细胞接种于96 孔板中，5×103个/孔，分别在培养24、48 和72 h 时，每孔加入100 μL MTT 溶液（5 mg/mL），37 ℃培养4 h，加入200 μL 二甲基亚砜（DMSO）溶解结晶，10 min后用酶标仪检测各孔细胞450 nm波长处的光密度（D）值，以D值表示细胞增殖能力。

1.5 Transwell法检测A549细胞的迁移和侵袭能力

进行侵袭实验时，Transwell上室预铺人工基膜；进行迁移实验时，Transwell 上室不涂人工基膜。将200 μL 悬浮于无血清DMEM 培养基中的5×104个A549 细胞接种在上室中，下室添加含10%胎牛血清的DMEM培养基。在37 ℃、5%CO2中培养24 h后，将穿膜的细胞在室温下用10%甲醇固定20 min，在室温下用0.5%结晶紫染色10 min，在光学显微镜下计数。

1.6 WB检测调控miR‑323a‑3p与TM4SF1基因的表达 对NSCLC 组织和A549 细胞中TM4SF1、cyclin D1、p21、MMP‑2、MMP‑9蛋白表达的影响

使用RIPA裂解缓冲液提取NSCLC组织或A549细胞的总蛋白，并使用BCA蛋白质定量试剂盒测定蛋白质含量。取等量蛋白（50 µg/泳道）进行SDS‑PAGE（10%凝胶），然后将蛋白条带转移到聚偏二氟乙烯膜上，在室温下用5%脱脂牛奶封闭60 min，加TM4SF1、cyclin D1、p21、MMP‑2、MMP‑9 和GAPDH抗体（1∶1 000稀释），在4 ℃下放置过夜。过夜后将膜与辣根过氧化物酶偶联的二抗（1∶5 000稀释）一起在室温下放置60 min。通过增强的化学发光检测仪检测目标蛋白。最后，使用ImageJ软件分析蛋白条带的灰度值，以GAPDH为内参计算目的蛋白的相对表达量。

1.7 生物信息学预测和双荧光素酶报告基因实验分析miR‑323a‑3p与TM4SF1之间的靶向调控关系

利用StarBase（http://starbase.sysu.edu.cn/）在线工具预测出miR‑323a‑3p 与TM4SF1 的3'非翻译区（UTR）具有互补配对的序列。将含有miR‑323a‑3p结合位点的野生型（WT）或突变型（MUT）TM4SF1‑3' UTR 插入pGL3 荧光素酶载体中，分别命名为 TM4SF1‑WT、TM4SF1‑MUT。使用LipofectamineTM2000 试剂将 TM4SF1‑WT 或TM4SF1‑MUT 和50 nmol/L miR‑323a‑3p mimic 或50 nmol/L miR‑NC 共转染至A549 细胞，转染48 h后，根据试剂盒使用说明书，通过双荧光素酶报告系统进行荧光素酶活性分析。

1.8 裸鼠移植瘤实验调控miR‑323a‑3p 与TM4SF1基因的表达对检测A549细胞移植瘤生长能力的影响

BALB/c 裸鼠移植瘤的建立参照文献[9‑10]进行。A549细胞被转染后，将5×106个细胞注射到裸鼠的右侧腋下皮下。分为miR‑NC组、miR‑323a‑3p组、si‑NC组、si‑TM4SF1组、miR‑323a‑3p+pcDNA组和miR‑323a‑3p+pcDNA‑TM4SF1组，每组9只裸鼠。分别在第14、21和28天使用游标卡尺测量肿瘤长、短径，计算移植瘤体积，计算公式为V=长径×短径2/2。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 miR‑323a‑3p 和TM4SF1 在NSCLC 组织中表达状态

qPCR 检测结果显示，与癌旁组织比较，肺癌组织中miR‑323a‑3p 表达水平明显降低，TM4SF1 mRNA 表达水平显著升高（图1A、B，均P＜0.01）。WB 检测结果表明，与癌旁组织比较，肺癌组织中TM4SF1蛋白表达水平明显升高（图1C，P＜0.01）。

2.2 miR‑323a‑3p过表达使A549细胞的增殖能力减弱

qPCR 检测结果显示，A549 细胞中转染miR‑323a‑3p mimic后，与miR‑NC组比较，miR‑323a‑3p组miR‑323a‑3p 表达水平明显升高（图2A，P＜0.01）。MTT检测数据显示，与miR‑NC组比较，miR‑323a‑3p组48和72 h 时的细胞增殖能力明显减弱（图2B，均P＜0.01）。WB 检测结果表明，miR‑323a‑3p 组cyclin D1 蛋白表达水平比miR‑NC 组降低（图2C，P＜0.01），p21 蛋白表达水平比miR‑NC 组升高（图2C，P＜0.01）。

2.3 miR‑323a‑3p过表达使A549细胞的迁移与侵袭能力减弱

Transwell实验检测结果显示，miR‑323a‑3p组A549细胞的迁移细胞数和侵袭细胞数明显低于miR‑NC组（图3A，均P＜0.01）。WB法检测结果表明，与miR‑NC组比较，miR‑323a‑3p 组细胞中MMP‑2、MMP‑9蛋白表达水平明显降低（图3B，均P＜0.01）。

2.4 miR‑323a‑3p靶向调控TM4SF1的表达

为了确定miR‑323a‑3p在NSCLC进展中的分子机制，使用StarBase工具预测了miR‑323a‑3p的潜在靶基因，分析结果（图4A）表明，TM4SF1的3'UTR含有miR‑323a‑3p的预测结合位点。双荧光素酶报告基因实验结果显示，与miR‑NC组比较，转染miR‑323a‑3p mimic的细胞荧光素酶活性在TM4SF1‑WT 组中明显降低（图4B，P＜0.01），而在TM4SF1‑MUT 组中没有显著差异。WB法检测miR‑323a‑3p对TM4SF1蛋白表达的调控（图4C），发现转染miR‑323a‑3p mimic明显降低TM4SF1蛋白的表达水平（P＜0.01），转染miR‑323a‑3p inhibitor后TM4SF1蛋白的表达水平显著升高（P＜0.01）。

2.5 抑制TM4SF1 表达使A549 细胞增殖、迁移与侵袭能力减弱

向A549细胞中转染si‑TM4SF1，WB法检测结果显示，与si‑NC组比较，si‑TM4SF1组的TM4SF1蛋白表达水平明显降低（图5A，P＜0.01），迁移细胞数和侵袭细胞数明显减少（图5B，P＜0.01），在转染后48和72 h 细胞的增殖能力明显减弱（图5C，均P＜0.01），cyclin D1蛋白、MMP‑2/9蛋白表达水平显著降低（图5A，均P＜0.01），而p21 蛋白表达水平大幅增加（图5A，P＜0.01）。

2.6 miR‑323a‑3p 通过TM4SF1 调控A549 细胞的增殖、迁移与侵袭

将miR‑323a‑3p mimic 和pcDNA‑TM4SF1 共转染至肺癌A549 细胞，WB 法检测结果显示，与miR‑323a‑3p mimic+pcDNA 组比较，miR‑323a‑3p+pcDNA‑TM4SF1 组细胞中TM4SF1 蛋白表达水平明显降低（图6A，P＜0.01），迁移细胞数和侵袭细胞数明显增加（图6B，均P＜0.01），细胞48 h和72 h的增殖能力明显增强（图6C，均P＜0.01），cyclin D1、MMP‑2/9蛋白表达水平显著升高（图6A，均P＜0.01），而p21蛋白表达水平明显降低（图6A，P＜0.01）。

2.7 同时转染miR‑323a‑3p 与pcDNA‑TM4SF1 可部分逆转前者单独转染对A549细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用

检测结果（图7）显示，在荷瘤裸鼠观察的14、21 和28 d，miR‑323a‑3p 组A549 细胞裸鼠移植瘤体积显著低于miR‑NC 组，si‑TM4SF1 组裸鼠移植瘤体积显著低于si‑NC 组（均P＜0.01），而miR‑323a‑3p+pcDNA‑TM4SF1 组较miR‑323a‑3p+pcDNA 组A549细胞裸鼠移植瘤体积显著增加（均P＜0.01）。

3 讨论

尽管近年来在NSCLC的诊断和靶向治疗方面已经取得了实质性进展，但是患者的5年总生存率仍然很低[11]。为NSCLC 的早期诊断、预后和治疗寻找有效的生物标志物仍然至关重要。在多种病理事件的病因中，miRNA充当转录后基因调节剂[12‑14]。主流观点认为miRNA的异常表达会影响癌症的进展，因此，对基于miRNA 的NSCLC 发生发展分子机制的深入研究可能为鉴定生物标志物和开发NSCLC新型治疗策略提供思路。

研究表明，miR‑323a‑3p在各种类型的癌症中发挥重要作用，包括膀胱癌[5]，前列腺癌[15]，神经胶质瘤[16]。miR‑323a‑3p 在胶质母细胞瘤中过表达，在体外能够抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖和迁移[17]。与非癌组织或人正常膀胱上皮细胞SV‑HUC‑1相比，膀胱癌组织或细胞中的miR‑323a 水平显著降低，敲降miR‑323a 表达显著增强了膀胱癌T24 和TCCSUP 细胞的迁移和侵袭能力[18]。在本研究中发现，与癌旁组织相比，miR‑323a‑3p 在NSCLC 组织中表达下调，与前人研究一致。此外，miR‑323a‑3p 过表达可显著抑制A549 细胞的增殖、迁移、侵袭及抑制A549 细胞裸鼠移植瘤的生长。该发现表明，miR‑323a‑3p 可能以肿瘤抑制因子的形式发挥作用。

迄今为止，很少有实验验 证miR‑323a‑3p 对TM4SF1的靶向调控。在本研究中，双荧光素酶报告基因实验分析和WB 法检测结果表明TM4SF1 是miR‑323a‑3p的直接靶标。TM4SF1位于染色体区域3q21‑3q25 处，是四次穿膜蛋白L6 超家族成员之一。TM4SF1是完整的膜糖蛋白，可将细胞外信号传递至细胞质[6]。既往研究[19]表明，TM4SF1 在NSCLC 细胞和组织中均上调，抑制TM4SF1表达可抑制肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭，并增强了A549和H1299细胞对顺铂和紫杉醇的敏感性。此外，TM4SF1沉默可导致NSCLC 细胞凋亡和G2/M 期停滞。TM4SF1 在NSCLC 组织中呈高表达，与肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移、TNM 分期相关，高表达TM4SF 可促进NSCLC 细胞迁移[20]。TM4SF1 在人乳腺癌细胞中高表达，抑制TM4SF1 可通过影响EMT 来抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭[21]。本实验同样观察到，TM4SF1在NSCLC组织中表达上调，抑制其表达可产生对A549细胞增殖、迁移、侵袭和裸鼠移植瘤生长的抑制作用。

miRNA可通过结合其靶基因的3'UTR调节基因表达，并诱导靶mRNA降解或抑制靶mRNA翻译[22]。TM4SF1 是miR‑30a/c 的直接靶标，miR‑30a/c 通过靶向TM4SF1 抑制NSCLC 细胞的干细胞增殖[23]。miR‑323a‑3p 通过靶向乳酸 脱氢酶A（lactate dehydrogenase A，LDHA）抑制骨肉瘤细胞的生长并抑制骨肉瘤的糖酵解[4]。但是，尚不清楚miR‑323a‑3p发挥作用的具体分子机制是否与TM4SF1表达有关。本研究中证实miR‑323a‑3p 特异性靶向A549 细胞中的TM4SF1。与癌旁组织相比，TM4SF1 mRNA 和蛋白在NSCLC 组织中呈高表达，并且其水平与miR‑323a‑3p在NSCLC组织中的表达相反。此外，在miR‑323a‑3p 过表达的细胞中，TM4SF1 的蛋白表达显著降低，而抑制miR‑323a‑3p表达时，TM4SF1的蛋白表达显著升高。并且上调TM4SF1 表达逆转了miR‑323a‑3p 过表达对肺癌A549 细胞增殖、迁移、侵袭和裸鼠移植瘤生长的抑制作用。本研究提供了miR‑323a‑3p 可通过抑制TM4SF1 而抑制NSCLC 细胞增殖、迁移和侵袭的证据。

综上，本研究结果表明，miR‑323a‑3p 在NSCLC组织中呈低表达，可通过直接靶向TM4SF1充当肿瘤抑制因子，抑制NSCLC A549细胞的增殖和迁移及抑制A549 细胞裸鼠移植瘤的生长。此外，本项研究结果进一步阐明了miR‑323a‑3p/TM4SF1 分子网络在NSCLC进展中的重要性。