circ_0000615通过靶向miR-432-5p调控胆管癌细胞的增殖、迁移和侵袭

关沧海，王海存，于少博，高欣，姜兴明，孙东升（哈尔滨医科大学附属第二医院.普通外科；b.心肌缺血重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150086）

胆管癌是一种可发生在胆管任何部位的消化系统恶性肿瘤[1‑4]，患者的5 年生存率不足30%，其原因包括患者早期症状不明显、肿瘤解剖位置不易明确以及缺乏特异性的分子标志物等[5‑6]。环状RNA（circular RNA，circRNA）是由前体mRNA 经反向剪切形成的闭合环状的RNA，许多circRNA 在人体多种生理病理过程，特别是在肿瘤的发生发展中发挥重要作用[7‑10]。有研究[11‑13]发现，circ_0000615 在乳腺癌、肾癌和胃癌等肿瘤中呈高表达，并通过吸附miRNA 进而调控肿瘤细胞的恶性生物学行为，然而circ_0000615 在胆管癌中的表达及其在胆管癌中的作用和相关机制尚少见报道。既往研究[14‑15]发现，miR‑432‑5p 在乳腺癌和肝癌中呈低表达并发挥抑癌作用。本研究通过生物信息学方法预测circ_0000615 与miR‑432‑5p间是否存在互补序列并用实验验证两者的靶向关系，同时探索circ_0000615 是否通过靶向miR‑432‑5p 调控胆管癌细胞的增殖、侵袭和迁移及其分子机制，以期为胆管癌的诊断和治疗提供新的潜在的治疗靶点和分子标志物。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂

本实验所用细胞，包括正常胆管上皮HIBEC细胞和胆管癌CCLP‑1、QBC939、TFK‑1 和RBE 细胞，其中除RBE 细胞购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心外，其余细胞均为本实验室保存。DMEM 培养基、胎牛血清及细胞转染试剂Lipofectamine®3000均购自美国Invitrogen公司，si‑NC、si‑circ_0000615（si‑circ‑1、si‑circ‑2）、miR‑NC、miR‑432‑5p mimic、inhibitor‑NC 和inhibitor‑miR‑432‑5p均购自上海吉玛公司，TRIzol试剂、cDNA逆转录试剂盒和SYBR Green Master试剂盒均购自瑞士Roche 公司，RNase R 购自上海碧云天公司，CCK‑8 试剂盒购自日本Dojindo 公司，EdU 试剂盒购自广州Ribobio公司，基质胶（matrigel）购自美国BD公司，Transwell小室购自美国Corning公司，双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司。

1.2 细胞培养、分组和转染

将CCLP‑1、QBC939、RBE 和TFK‑1 细胞等胆管癌细胞和正常胆管上皮HIBEC细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，在37°C、5%CO2的条件下进行培养，当细胞生长至汇合度约70%时，进行传代培养。转染前将CCLP‑1 和QBC939 细胞（500 个细胞/孔）接种于6孔板，待细胞汇合度达40%～50%时进行转染。

细胞分组及转染：si‑NC 组（转染si‑circ NC），si‑circ‑1 组（转染si‑circ‑1），si‑circ‑2 组（转染si‑circ‑1），si‑NC+inh‑NC 组（转染si‑circ NC+inhibitor NC），si‑NC+inh‑miR‑432‑5p 组（转染si‑circ NC+inhibitor‑miR‑432‑5p），si‑circ‑1+inh‑miR‑432‑5p 组（转染si‑circ‑1+inhibitor‑miR‑432‑5p）。用Lipofectamine®3000将不同组合的质粒转染至CCLP‑1 和QBC939 细胞。转染后继续培养细胞至对数生长期，收集细胞进行后续实验。

1.3 qPCR 检测转染前后CCLP‑1 和QBC939 细胞中circ_0000615、miR‑432‑5p的表达

用TRIzol试剂盒提取转染前后细胞总RNA，电泳验证完整性后，通过逆转录试剂盒将RNA 逆转录成cDNA，利用SYBR Green试剂进行qPCR实验。引物序列：circ_0000615正向引物为5'‑GCGCTCAATCCT TTGGGAAC‑3'，反向引物为5'‑GGACAACATCAT TGCTTTTCAGAC‑3'；miR‑432‑5p正向引物为5'‑ACACTCCAGCTGGGTCTTGGAGTAGGTCA‑3'，反向引物为5'‑TGGTGTCGTGGAGTCG‑3'；GADPH正向引物为5'‑GGGAGCCAAAAGGGTCAT‑3'，反向引物为5'‑GAGTCCTTCCACGATACCAA‑3'；U6正向引物为5'‑GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT‑3'，反向引物为5'‑CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT‑3'。PCR扩增条件：95°C 10 min，95°C 12 s、50°C 30 s、72°C 30 s，共40个循环。每个样本设3个复孔。以GAPDH和U6作为内参基因，用2‑ΔΔCt方法计算circ_0000615、miR‑432‑5p的相对表达量。

1.4 RNase R酶切circ_0000615实验

从胆管癌CCLP‑1、QBC939 细胞中抽提出总RNA，RNase R 组RNA 样本与RNase R 酶混合反应15 min，NC 组RNA 样本经稀释缓冲液处理15 min，之后两组RNA 样本按1.3 方法，用qPCR 检测细胞中GAPDH和circ_0000615的表达水平。

1.5 双荧光素酶报告基因实验验证circ_0000615 与miR‑432‑5p之间的靶向关系

通过在线生物信息学分析网站（Circinteractome）预测circ_0000615 和miR‑432‑5p 之间存在互补结合位点，将含有miR‑432‑5p与circ_0000615互补结合部位的序列插入双荧光素酶基因报告基因载体pmirGLO 构建野生型质粒（circ_0000615‑WT），将上述序列突变序列构建突变型质粒（circ_0000615‑MUT）。用Lipofectamine®3000 将报告基因质粒与miR‑432‑5p mimic 或miR‑NC 共转染至对数生长期的CCLP‑1、QBC939 细胞，转染48 h 后收集细胞，用双荧光素酶报告实验试剂盒检测细胞中荧光素酶活性。

1.6 CCK‑8法检测转染后各组CCLP‑1和QBC939细胞的增殖能力

将转染后处对数生长期的各组细胞用胰酶消化后，以1×103个细胞/孔接种于96 孔板中，每组设5 个复孔，培养至0、24、48 和72 h 时加入10 μL 的CCK‑8溶液，继续培养4 h，用酶标仪在450 nm 波长处检测每孔的光密度（D）值，以D值表示细胞的增殖能力。

1.7 EdU 实验检测转染后各组CCLP‑1、QBC939 细胞的增殖能力

将转染后的各组细胞以1×104个细胞/孔接种到96 孔板，培养24 h 后在每个孔中加入100 μL EdU 溶液，继续培养2 h，用多聚甲醛固定细胞，随后在避光条件下用Apollo 567 和Hoechst 33342 进行染色。用倒置荧光显微镜观察、计算EdU 阳性细胞数量并拍照，将Apollo 567 阳性细胞与Hoechst 33342 标记细胞数量的比值作为EdU阳性细胞率。

1.8 Transwell实验检测转染后各组CCLP‑1、QBC939细胞的迁移、侵袭能力

细胞迁移实验：将含1×105个细胞的悬液（200 μL）接种于Transwell 上室，随后在下室加入800 μL 含10%胎牛血清的DMEM培养基。培养24 h后用棉签擦去上室中的细胞，并依次进行甲醛固定以及结晶紫染色。细胞侵袭实验：在加入细胞悬液前在Transwell 上室预铺基质胶，后续实验步骤同迁移实验。实验最后，在光学显微镜下随机选取5个视野进行观察、计数迁移或侵袭细胞并拍照。

1.9 统计学处理

以上实验均独立重复3次。使用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析，用GraphPad Prism 6.0 软件绘制相关图像。符合正态分布的计量数据以表示，配对数据采用配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05 或P＜0.01 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 在胆管癌细胞中circ_0000615呈高表达而miR‑432‑5p呈低表达

qPCR 检测结果显示，与HIBEC 细胞比较，CCLP‑1、QBC939、RBE 和TFK‑1 细胞中circ_0000615 呈高水平表达（P＜0.05 或P＜0.01，图1A），CCLP‑1 和QBC939 细胞中表达水平较其他细胞更高，故选取这2种细胞进行后续实验；与HIBEC细胞比较，miR‑432‑5p在CCLP‑1、QBC939、RBE和TFK‑1细胞中呈低水平表达（P＜0.05 或P＜0.01，图1B）。RNase R酶切实验结果（图1C）显示，与NC 组样本比较，RNase R处理的样本中，虽然GAPDH含量明显降低（P＜0.01），但circ_0000615 含量无明显明显变化（P＞0.05），说明circ_0000615 可以抵抗RNase R 酶切，上述结果证明circ_0000615 具有比线性RNA 更稳定的环状结构。

2.2 双荧光素酶报告基因实验证实circ_0000615 与miR‑432‑5p间存在靶向关系

根据生物信息学数据库（Circinteractome）的预测显示，circ_0000615与miR‑432‑5p之间存在互补结合序列（图2A）。双荧光素酶报告基因实验结果（图2B）显示，与miR‑432‑5p NC比较，miR‑432‑5p mimic+circ_0000615 WT 组细胞的荧光素酶活性显著降低（P＜0.01），miR‑432‑5p mimic+circ_0000615 MUT 组细胞的荧光素酶活性无显著变化（P＞0.05），这一结果证实circ_0000615 与miR‑432‑5p 之间存在靶向结合关系。

2.3 敲减circ_0000615 可抑制CCLP‑1、QBC939 细胞的增殖、侵袭和迁移能力

qPCR检测结果（图3A、B）显示，与si‑NC组比较，si‑circ‑1 和si‑circ‑2两组中两种细胞中的circ_0000615表达水平均显著低降低（P＜0.05 或P＜0.01），miR‑432‑5p 的表达水平显著升高（P＜0.01或P＜0.001），说明敲减circ_0000615的实验成功；同时还发现敲减circ_0000615 后miR‑432‑5p表达升高，说明前者负调控后者的表达。CCK‑8 法（图3C）和EdU 实验（图3D）结果显示，与si‑NC 组相比，si‑circ_0000615 组的细胞增殖能力明显降低（P＜0.05 或P＜0.01）。Transwell侵袭实验（图3E）和迁移实验（图3F）结果显示，与si‑NC组相比，si‑circ_0000615 组细胞的迁移和侵袭能力明显降低（P＜0.05或P＜0.01）。上述结果说明，敲减circ_0000615 可抑制CCLP‑1、QBC939 细胞的增殖、侵袭和迁移能力。

2.4 下调miR‑432‑5p可部分逆转由敲减circ_0000615产生的对CCLP‑1 和QBC939 细胞增殖、迁移和侵袭的促进作用

qPCR（图4A）、CCK‑8 法（图4B）、EdU 增殖实验（图4C）、Transwell迁移（图4D）和侵袭实验（图4E）结果显示：与si‑NC+inh‑NC组相比，si‑NC+inh‑miR‑432‑5p 组miR‑432‑5p 的表达明显降低（P＜0.05），说明inhibitor‑miR‑432‑5p转染成功后显著抑制了miR‑432‑5p的表达；同时，CCLP‑1 和QBC939 细胞的增殖、迁移、侵袭能力明显升高（P＜0.01 或P＜0.001），说明下调miR‑432‑5p 可增强CCLP‑1 和QBC939细胞的增殖、迁移和侵袭能力，此外，si‑circ‑1+inh‑miR‑432‑5p 组细胞的增殖、迁移、侵袭能力明显弱于si‑NC+inh‑miR‑432‑5p 组（P＜0.05 或P＜0.01），但又高于si‑NC+inh‑NC组（P＜0.05），说明下调miR‑432‑5p可部分逆转由敲减circ_0000615产生的对CCLP‑1 和QBC939 细胞的恶性生物学行为的促进作用。

3 讨论

手术切除是目前治疗胆管癌最有效的手段，但大多数胆管癌患者直到晚期才被诊断，难以通过手术进行根治切除。因此，探索胆管癌发生发展的分子机制以及有效的生物学标志物是十分必要的。circRNA 在肿瘤发生和发展中的关键作用已成为研究焦点[16‑18]。circ_0000615 在乳腺癌中表达上调并通过海绵吸附miR‑145‑5p 促进细胞增殖、迁移和侵袭[11]；circ_0000615 通过miR‑138‑5p/FoxP4 轴促进肾癌的发生发展[12]。然而，circ_0000615 在胆管癌中的表达及其能否调控胆管癌的发生发展，目前尚不清楚。此外，miRNA 在肿瘤发生发展过程中也起重要作用[19‑22]。例如，miR‑432‑5p 在胶质瘤中通过抑制下游促癌基因RAB10的表达从而起到抑癌作用[23]。目前，尚无研究指出miR‑432‑5p 在胆管癌中能否发挥调控作用。

本研究首次发现circ_0000615 和miR‑432‑5p在胆管癌细胞中呈异常表达，qPCR 检测结果表明胆管癌CCLP‑1、QBC939、RBE 和TFK‑1 细胞中circ_0000615 的表达水平明显高于正常胆管上皮HIBEC 细胞；miR‑432‑5p 在胆管癌细胞中明显低表达。值得注意的是，circRNA 可以与mRNA 竞争性结合miRNA，miRNA 也能直接结合circRNA或通过影响相关转录因子的表达间接调控circRNA，从而促进或抑制肿瘤的发生发展[11‑13]。本研究通过在线生物信息学分析网站预测发现circ_0000615 与miR‑432‑5p 之间存在结合位点，并用双荧光素酶报告基因实验证实circ_0000615与miR‑432‑5p 存在靶向结合关系。本研究体外转染实验发现，敲减circ_0000615 表达后可使CCLP‑1、QBC939 细胞中miR‑432‑5p 表达水平升高，细胞的增殖、侵袭和迁移能力降低，说明miR‑432‑5p可能是一个抑癌基因，上调其表达水平可以抑制胆管癌细胞的恶性生物学行为；在未经干预的胆管癌细胞中circ_0000615 呈高表达状态，circ_0000615抑制了miR‑432‑5p 在胆管癌细胞中的表达，后者的抑癌效应没有显示出来，在敲减circ_0000615后，miR‑432‑5p的抑癌作用就表现出来了。

综上所述，本研究证实circ_0000615在胆管癌细胞中呈高水平表达，而miR‑432‑5p 呈低水平表达；circ_0000615 促进胆管癌细胞的增殖、侵袭、迁移等恶性生物学行为，这一结果与靶向抑制miR‑432‑5p的表达有关。这些结果提示，circ_0000615可能成为胆管癌诊断和治疗的分子靶标，敲减circ_0000615或过表达miR‑432‑5p 有望作为胆管癌的治疗有效措施，进而为临床转化提供理论基础，但circ_0000615/miR‑432‑5p 轴如何调控胆管癌细胞的恶性生物学行为的上下游分子机制仍然需要深入探索。