HSP70抑制剂在结直肠癌治疗中的研究进展

刘艳飞 综述；张春泽，张庆怀审阅（1.天津中医药大学 研究生院，天津 301617；.天津市人民医院肛肠外科，天津 30011）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）又名大肠癌，在全球常见的恶性肿瘤中发病率和病死率均居于前三位[1]。虽然在对CRC 的临床治疗上取得了巨大进展，但CRC 对传统化疗药物产生耐药性和患者术后预后不良的情况日益突显，需要进一步寻找有效疗法。热激蛋白70（heat shock proteins70，HSP70）是细胞应激状态下异常高表达的蛋白[2]，参与细胞内蛋白质的折叠、降解以及调节细胞凋亡[3]。研究[4]表明，与正常细胞相比，HSP70在多种恶性肿瘤细胞中呈高表达，这可能是肿瘤发生和肿瘤对化疗药物耐药的原因之一。因此，研究HSP70 在CRC 发生发展过程中的分子机制以及HSP70抑制剂对肿瘤细胞的作用机制，有助于找到使患者受益的新治疗策略。

1 HSP70在维持细胞的生存和功能中发挥重要作用

HSP70家族是进化最保守的蛋白家族之一，其家族主要包括HSP72、热激同源蛋白70（heat shock cognate protein70，HSC70）、内质网（endoplasmicreticulum，ER）中的葡萄糖调节蛋白78（78 kD glucose‑regulated protein，GRP78；又称heat shock 70 kD protein 5，HSPA5）和线粒体中的mtHSP70[mitochondrial HSP70，mtHSP70又称寿命蛋白（mortalin，MOT）等[5]。HSP70的结构主要包括核苷酸结合域（nucleotide‑binding domain，NBD）、底物结合结构域（substrate‑binding domain，SBD）、底物结合结构域Lid 和C‑末端结构域（C‑terminal peptide‑binding domain，CTD）[3]。NBD可与ATP相结合，并将其水解为ADP，多肽底物与SBD结合后，HSP70可对后者进行折叠、组装、穿膜运输或降解[6]，HSP70 C‑末端的EEVD基序（一种保守的EEVD四肽）负责底物的结合和再折叠[7]。

HSP70 水解ATP 的速度非常缓慢，需要协同伴侣来提高其ATP 酶的活性，从而加速水解。协同蛋白主要与HSP70 的不同结构域相互结合而发挥作用。协同伴侣，其主要包括以下3 类：（1）J 域协同伴侣主要与HSP70 的NBD 相结合，引起NBD 变构，刺激ATP 酶活性，加速ATP 水解。（2）核苷酸变换因子（nucleotide exchange factor，NEF），其与HSP70 的NBD 相结合，促进ATP水解后ADP/ATP的交换[6]，NEF主要包括GrpE家族、Bcl2相关的异基因（Bcl2‑associated athanogene，BAG）家族、HSP70‑核苷酸交换因子Fes1 及人类同源HSP70 结合蛋白（HSP70‑binding protein 1，HSPBP1）等。（3）与EEVD域相结合的协同伴侣，主要包括HSP70/HSP90 组织蛋白（HSP organizing protein，HOP）和联合蛋白CHIP（C‑terminal of HSP70 interacting protein）。HOP是HSP70 和HSP90 共同伴侣蛋白，可以促进两者相互结合，参与蛋白折叠[3]。而CHIP 是泛素‑蛋白酶体系统与热激反应途径之间的重要联系,负责HSP70/HSP90的相互作用，参与多种底物的泛素化与错误蛋白的降解过程[8]。

2 HSP70家族蛋白在CRC细胞内呈高表达

HSP70 在细胞应激状态如缺氧、热激、营养缺乏时表达被上调[9]。研究[2]表明，HSP70 在包括CRC 在内的多种恶性肿瘤细胞中呈高表达，并介导多种恶性行为，如抗细胞凋亡、抗肿瘤免疫反应、诱导血管生成、促进肿瘤生长和细胞迁移等。HSP70 在CRC的发生和发展中起着重要作用。研究[10]发现，HSP70与CRC 的不良预后和生存率相关。而且MOT 通过促进细胞增殖和EMT来促进CRC细胞的转移，且与患者总生存率呈正相关[11]，这表明HSP70可能是一个很有潜力的肿瘤转移治疗靶点。此外，GRP78 在CRC中过表达，可调节CRC中关键的失调信号通路，如减少蛋白质的错误折叠、增加蛋白质清除等[12]。而下调GRP78的表达可以抑制CRC细胞的增殖和迁移并诱导其凋亡[13]。GRP78还与CRC患者生存率密切相关，低水平GRP78患者生存率更高[14]，因此GRP78可能具有治疗CRC 的潜力并有望成为其预后标志物。

3 HSP70抑制剂对CRC的治疗

3.1 腺苷衍生物类HSP70抑制剂VER‑155008

VER‑155008 是一类有代表性的腺苷衍生类HSP70抑制剂，可与HSC70和HSP70的核苷酸结合位点结合，竞争性抑制HSP70 ATP酶活性[15‑16]。VER‑155008 还可以与HSP70 的NBD 域结合，抑制NBD 和SBD 之间的变构作用[17]。此外，VER155008通过抑制HSP27、HOP和HSP90的表达，诱导细胞凋亡和抑制癌细胞的生长[18]。除了结合HSC70 和HSP70，VER‑155008 还可以抑制GRP78[19]，这说明它很可能是一种非特异性的广泛抑制剂，可作用于HSP70家族的各种亚型。VER‑155008具有对多种恶性肿瘤细胞系的抗癌活性，如CRC、肺癌、多发性骨髓瘤、胸膜间皮瘤等[20‑23]。但VER‑155008 因其疏水性会在体内被快速代谢和清除，导致生物利用度低，且在肿瘤组织内的水平低于预期的药理活性水平[24]，有研究[22]表明，纳米给药系统为增强VER‑155008 的渗透性和保留性提供了可能，将VER‑155008包封在纳米颗粒中形成VER‑155008 胶束，并证明了VER‑155008 胶束可下调HSP70 的表达，降低CRC 细胞的耐热性，增强温热治疗的凋亡效应，从而提高疗效。纳米给药系统可能为提高VER‑155008等化疗药物的疗效提供切实可行的方法。

3.2 GRP78抑制剂

GRP78是一种具有抗凋亡特性的内质网应激信号调节因子，其过表达可以激活PI3K‑Akt 和MAPK信号通路从而抑制细胞凋亡，以及增强癌细胞对缺氧环境的适应和抵抗[25]，还可以激活未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）促进癌细胞的生存、增殖、转移和耐药[26]。此外，GRP78 在调节某些肿瘤微环境的血管系统方面起着重要作用。敲除GRP78可以显著降低肿瘤的血管形成和生长，且GRP78 相关的UPR也参与肿瘤血管形成[27]。GRP78水平还与CRC 对化疗诱导凋亡的敏感性相关，其高表达可以增加CRC的抗药性[28]，抑制GRP78可以降低ER应激信号并通过PERK/eIF2α 和IRE1α/XBP‑1 和促进CRC 凋亡[14]。因此，抑制GRP78 可能成为治疗CRC并增强化疗药物疗效的一种有效策略。

研究表明，钌（Ⅱ/Ⅲ）复合物不仅可以诱导CRC凋亡并导致G2/M期细胞周期停滞，还可以通过增加BAX 和caspase‑3 表达、减少Bcl2 表达杀死癌细胞，还可以通过抑制血管生成来预防癌细胞转移[29]。PURUSHOTHAMAN 等[30]合成了一种新型的钌（Ⅱ）三嗪络合物1[Ru（bdpta）（tpy）]2+，该复合物与GRP78之间的直接相互作用可引起活性氧自由基（ROS）介导的GRP78泛素化，可显著降低GRP78水平，因此被认为可能成为克服铂类衍生物引起的耐药性和肿瘤复发的替代化疗药物。此外，siRNA 能够抑制CRC增殖并诱导其凋亡[31]、通过抑制GRP78 表达提高CRC 对化疗药物的敏感性[32]，如增强CRC 的凋亡和对5‑氟尿嘧啶（5‑FU）的敏感性[33]，还可以使CRC 对奥沙利铂敏感[34]。

3.3 天然化合物衍生的HSP70抑制剂

天然存在的生物活性化合物在癌症预防和治疗中发挥着越来越重要的作用。GONG 等[13]发现三萜类小檗碱可以抑制GRP78的表达及其在细胞表面的定位，还可以通过抑制Bcl2、原癌基因c‑Myc和波形蛋白的表达，上调CRC角蛋白的表达，从而抑制CRC的增殖和迁移。

表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是从绿茶中提取的一种有效的儿茶素。EGCG 在ATP 结合位点直接与GRP78 相互作用，并通过竞争性结合ATP从而抑制ATP酶的活性。EGCG 竞争性结合可导致GRP78 从其活性单体转化为非活性二聚体和低聚物形式[35]。EGCG 还可以抑制GRP78 的表达、激活核转录因子（NF‑κB）通路，导致caspase‑3 和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）活化、Bcl2降低，最终导致癌细胞凋亡[36]。此外，EGCG可以增强CRC对5‑FU的敏感性，研究[36]数据显示，与5‑FU 或EGCG 单独治疗相比，两者的联合应用可显著促进CRC细胞凋亡和DNA损伤。

槲皮素（3，3'，4'，5，7‑五羟基黄酮）是一种天然类黄酮化合物，可以通过促进caspase‑3的激活和PARP的裂解降低HSP 的常见转录因子热激因子1（heat shock factor 1，HSF1）的水平，从而抑制HSP70 表达，以剂量和时间依赖性方式抑制细胞生长[37]。槲皮素抑制HSP70的表达可激活c‑JunNH2‑末端激酶（JNK）途径、抑制ERK的磷酸化并增加caspase‑3的激活，从而导致细胞凋亡，其中MAPK 信号通路也参与了该过程[38]。槲皮素可以有效抑制HSP27、HSP70 和HSP90 的表达，促进癌细胞凋亡[37]。同时，槲皮素可 以通过介导hsa_circ_0006990/miR‑132‑3p/MUC13轴显著抑制CRC 的进展[39]。但是，槲皮素极端不溶于水的特性和口服时生物利用度低的问题，阻碍了探索其不同给药方案在临床试验中的表现。有研究[40]发现，脂质体槲皮素可以显著提高槲皮素的溶解度和生物利用度，改善其在作用部位的靶向能力。此外，槲皮素基于脂质体的药物递送系统与其他抗癌药物联用不仅具有显著的治疗活性、安全性、生物相容性、生物降解性，还可以减轻药物毒性[41‑42]。

另一种天然化合物咖啡白脂，主要从咖啡中提取，可以抑制HSP70 的表达，增加caspase‑3 和PARP的表达，以剂量依赖的方式降低Bcl2和磷酸化Akt的表达，从而诱导CRC细胞凋亡。此外，用HSP70抑制剂雷公藤内酯预处理可以增强咖啡白脂的毒性、进一步降低CRC 细胞活力，证实了咖啡白脂通过抑制HSP70从而诱导CRC细胞凋亡的机制[43]。

对香豆酸（p‑Coumaric acid，p‑CA）是天然存在的酚酸，存在于大多数植物和蔬果中，可以通过激活PERK‑eIF2α‑ATF‑4‑CHOP 途径从而抑制CRC 细胞中GRP78 的上调、靶向激活UPR 诱导的细胞凋亡[44]。p‑CA还能够通过改变BAX和Bcl2表达水平，显著增加CRC细胞凋亡[45]。

斑蝥素（cantharidin，CTD）是一种从水泡甲虫中分离出来的萜类化合物，可以通过阻止HSF1与其启动子结合，抑制HSP70和Bag3蛋白的表达水平，从而诱导CRC细胞凋亡[46]。但是CTD的细胞毒性限制了其进一步的临床应用，因此临床通常使用毒性减弱的CTD衍生物或制备负载胶束以降低毒性[47]。

3.4 苯乙基磺酰胺衍生的HSP70抑制剂

2‑苯基乙炔磺酰胺（pifithrin‑μ，PES）是一种强效的HSP70 选择性抑制剂，可以与HSP70 的SBD 结合使其结构发生改变，破坏HSP70 与其他分子伴侣的相互作用[48]。PES 还可以作用于HSP70/HSP90 或直接与p53 交联，影响p53 蛋白的修饰、积聚及输出能力，从而破坏自噬溶酶体和蛋白酶体途径[49]。研究[50]发现，PES 可以抑制X 连锁凋亡抑制蛋白（X‑linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP）及Akt和细胞外信号调节激酶的磷酸化，破坏HSP70和XIAP之间的相互作用，从而抑制癌细胞的增殖并促进其凋亡。MCKEON等[51]发现一种合成2‑苯基乙炔磺酰胺的新方法，该方法可得到高纯度的2‑苯基乙炔磺酰胺，该团队还发现了PES和奥沙利铂联合对CRC具有较强的协同治疗作用，与顺铂联合对前列腺癌具有中等程度的协同治疗作用。

3.5 咪唑衍生的HSP70抑制剂

凋亡因子（apoptozole，Az）是抑制HSC70 和HSP70的小分子物质[52]，可以与HSP70的ATP酶域结合而抑制其ATP酶活性，激活caspase诱导细胞凋亡，但不影响HSP40、HSP60 和HSP90[53]。Az 还可以作用于癌细胞的溶酶体，诱导溶酶体膜通透化，促进溶酶体介导的细胞凋亡。在小鼠CRC 模型中可以观察到Az 显著的肿瘤生长抑制作用[12]。Az衍生物Az‑TPP‑O3主要定位于癌细胞的线粒体，通过抑制线粒体中MOT与p53的相互作用并诱导线粒体外膜通透化导致线粒体介导的细胞凋亡。与Az 不同的是，Az‑TPP‑O3对癌细胞中的自噬过程没有影响[54]。

3.6 MKT‑077类抑制剂与藜芦碱

MKT‑077 是一类阳离子的花氰染料，可与HSP70的NBD结合，干扰蛋白的相互作用，其结合位点位于HSC70 核苷酸结合裂口附近的口袋中，有利于保持伪ADP 结合构象[55]。用MKT‑077 处理CRC HCT116 细胞可使其对膜攻击复合物介导的细胞死亡敏感[56]。MKT‑077还可以通过抑制寿命蛋白、增加线粒体膜通透性诱导CRC 细胞凋亡[57]。虽然MKT‑077有抗增殖活性，但代谢迅速，这限制了其作为化学探针或潜在治疗剂的应用，因此LI 等[58]研究并合成了多种结构更稳定的衍生类似物，如YM‑1、JG‑83、JG‑84 和JG‑98。JG‑98 是第二代衍生物，主要通过与HSP70 结合下调热激反应破坏HSP70 与Bag3 的相互作用，抑制ERK1/2 的去磷酸化、导致细胞凋亡。敲除HSP70 基因可下调CRC模型中的原癌基因c‑Myc，且不受Bag3 的影响[59]。JG‑98通过抑制MOT可以有效抑制对凡德他尼和卡博替尼耐药的甲状腺癌细胞的活力[60]。与MKT‑077相比，JG‑98 对HSP70 具有更好的结合力，其抗肿瘤能力也更强，其活性和半衰期分别提高了至少3倍和7倍[58]。JG‑98的变构类似物JG‑231和JG‑294具有中等纳摩尔浓度，对非转化细胞的毒性相对较小，可以结合HSP70上预期的变构位点，中断HSP70‑Bag3在体外和细胞中的相互作用。JG‑231及其类似物可能将作为POC化学探针用于研究HSP70在癌症和其他疾病中的作用[61]。

藜芦碱（veratridine，VTD）是一种从植物中提取的生物碱，可通过诱导抗癌蛋白UBXN2A 在CRC 细胞中表达，从而抑制MOT 和肿瘤抑制蛋白WT‑p53的再激活，还可以促进CHIP 的羧基末端泛素化，增加CRC 细胞中MOT2 的蛋白酶体降解，而且UBXN2A‑CHIP 轴在富含MOT2 的CRC 细胞中具有协同的抑癌活性[62‑63]。

3.7 青蒿素衍生物类抑制剂

青蒿素是经典的抗疟药物，其半合成衍生物双氢青蒿素（Dihydroartemisinin，DHA）可以降低HSP70 mRNA 和蛋白水平，从而诱导癌细胞的凋亡[64]，还可以增强CRC 细胞对5‑FU 的敏感性[65]。青蒿素另一个半合成衍生物青蒿琥酯（artesunate，ART）不仅可以抑制HSP70 ATP 酶活性，还可以通过抑制HSP70 表达诱导caspase 依赖性细胞凋亡[66]。ART 在体内外均可以使caspase‑3、PARP、caspase‑9水平升高，使Bcl2水平下降，从而诱导CRC凋亡和自噬[67]。此外，ART 通过对氧化应激和促炎信号的抑制，可以降低患结肠癌的风险[68]。

3.8 其他种类抑制剂

亚甲蓝（methylene blue，MB）是一种药物及染料，可作为抗氧化剂和抗炎剂。MB通过抑制HSP70可降低非小细胞肺癌细胞活性，从而发挥抗癌活性，与应用HSP90的抑制剂新霉素相比，经MB处理的癌细胞具有较低的细胞活力，两者联合应用可致使癌细胞活力进一步降低[69]。亚甲蓝的光动力疗法可以用于治疗CRC，但含有亚甲蓝制剂的给药问题以及在适当的停留时间内不能与特定部位获得紧密接触，使其不能广泛应用，而包含亚甲蓝的黏膜黏附热反应系统构成了一种可能有用的治疗CRC 的方法[70]。

4 结语

HSP70作为有潜力的抗癌靶点，在临床试验和应用方面都取得了巨大进展，HSP70 抑制剂在CRC 的增殖、转移、抗药性等方面都发挥了重要作用，但这些抑制剂的应用也存在一些弊端。如VER‑155008虽然是应用广泛的HSP70 抑制剂，但是会在体内被快速代谢和清除，其生物利用度较差，纳米给药系统虽然为弥补这一不足提供了可能，但仍需改善；钌（Ⅱ/Ⅲ）复合物和PES 对CRC 的作用和分子机制仍需进一步的实验研究；多种天然化合物均可通过抑制HSP70 或GRP78 促进CRC 细胞凋亡，且大多对正常细胞无明显不良影响，但大多停留在临床前的研究阶段，而其中CTD 则因为其细胞毒性导致在进一步的临床应用中受到限制；MKT‑077 最常见的不良反应为出现不可逆的肾脏毒性和低镁血症，这阻碍了其治疗剂量相关的临床试验研究；MB大多作为染料用于CRC 的镜检和淋巴结检测，对CRC 的治疗作用仍有待开发。相信随着对HSP70 研究的不断深入，抑制HSP70 作为一种有前景的CRC 的治疗策略方向，在该领域有望出现高活性、高选择性、低不良反应和良好特性的药物。