基于GEO 基因芯片结合网络药理学和分子对接技术探究火把花根片治疗IgA 肾病的作用机制

秦苏杨，任秋安,王耀光*

（1.天津中医药大学第一附属医院，天津 300193；2.国家中医针灸临床医学研究中心，天津 300193）

IgA 肾病（IgA nephropathy, IgAN）是世界范围内最常见的原发性肾小球疾病， 其特征是循环免疫球蛋白A（immunoglobulin A, IgA）和肾系膜IgA 沉积异常[1-2]。 临床中，其主要表现为无症状血尿（如肉眼血尿、镜下血尿有或无伴随蛋白尿）、进行性肾病（蛋白尿无伴随血尿、肾病综合征），严重者甚至伴随进行性肾衰竭。 不良预后相关因素包括高血压、蛋白尿、表皮生长因子受体降低，发病人群以成年人为主[3]。目前，IgAN 的西医治疗药物以激素以及免疫抑制剂等为主，同时还可通过改善患者生活方式、控制血压、行扁桃体切除术等进行支持治疗。 但激素与免疫抑制剂的价格及不良反应均在一定程度上加重患者的负担[4]，因此，利用中医药优势寻找替代疗法显得尤为必要。

IgAN 在中医学属于“水肿”“肾风”“血尿”“肾着”等范畴，以伏邪、瘀血等理论进行辨证论治，临床常用雷公藤、黄葵及类属中成药[5-7]。火把花根片(HBHGT)是由昆明山海棠根加工而成，目前已证实HBHGT具有良好的免疫调节和抗炎作用[8]。 有临床证据表明，HBHGT 可缓解炎症、减少尿蛋白、延缓IgAN 进展，且其具有无生物毒性的优点[9-11]。 但其治疗IgAN的作用机制尚未十分明确，本文通过生物信息学、网络药理学和分子对接技术手段， 预测潜在作用靶点和信号通路，以期明确作用机制，为临床用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 IgAN 的基因芯片及差异分析

在NCBI 的GEO 数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds）以“IgA Nephropathy”为关键词检索IgA肾病样本。 选取含IgAN 样本与正常样本的数据集5 组（GSE37460、GSE93798、GSE35489、GSE104948、GSE99340）为研究对象。通过R 4.1.2 进行系统分析并利用normalize 函数进行归一化处理。 用Limma包筛选出差异基因，筛选条件为：logFC 绝对值>1，P<0.05 且校正P<0.05。

1.2 HBHGT 成分和靶点筛选

在TCMSP（https://tcmsp-e.com/tcmsp.php）、本草组鉴（http://herb.ac.cn）、BATMAN-TCM（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）查找HBHGT 的化学成分，并利用CNKI、PubMed 等数据库检索近十年（2011-2021 年）有关HBHGT 成分研究的文献进行补充[12-14]，通过PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库检索其分子结构，导入SwissADME（http://www.swissadme.ch/index.php），通过Linpinski 五规则[15]进行筛选，最后运用SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch)进行靶点预测，通过UniProt(https://www.uniprot.org/）数据库将获取的靶点名称进行规范。

1.3 疾病靶点数据库建立

在GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//www.omim.org/）、Drugback（https://go.drugbank.com/）数据库以“IgA Nephropathy”为关键词，检索IgAN 的靶点，整合后与“1.1”项中从GEO 数据库获得的差异基因取交集，建立疾病靶点数据库。

1.4 HBHGT 药物-成分-靶点网络图构建

将药物与疾病二者靶点取交集，得到HBHGT治疗IgAN 的潜在靶点。 运用Cytoscape 3.8.0 构建HBHGT 治疗IgAN 的药物-成分-靶点网络图，利用工具NetworkAnalyzer 分析成分的网络拓扑参数，包括连接度、介度及紧密度等[16]，从而得出发挥药效的主要成分。

1.5 核心靶点筛选及PPI 网络构建

将潜在靶点输入STRING 11.0 数据库(https://string-db.org)进行PPI 分析，其中最小互相作用阈值设为“highest confidence”（>0.9），生物种类设为“Homo sapiens”。 利用Cytoscape 3.8.0 软件的CytoNCA 插件对网络节点的连接度中心性（degree centrality, DC）、介度中心性（betweenness centrality,BC）、紧密度中心性（closeness centrality, CC）进行计算，并可视化呈现。

1.6 GO 与KEGG 富集分析

将潜在靶点录入注释可视化和集成发现数据库（database for annotation visualization and integrated discovery, DAVID），设定阈值P＜0.05，进行GO 注释和KEGG 富集分析，并用R 4.1.2 可视化呈现。

1.7 成分-靶点分子对接

将核心成分与核心靶点进行对接。 通过ZINC（http://zinc.docking.org）数据库、PDB（https://www.rcsb.org/）数据库分别查找核心成分和核心靶点的3D 结构，运用Auto Dock 4.2.6 逐一进行对接，根据Docking Score 值评价靶点与活性化合物的结合强度与活性[17]，再利用Pymol 2.5.0 软件对对接结果进行分析及绘图。

2 结果

2.1 IgAN 差异基因分析

GEO 数据集GSE37460、GSE93798、GSE35489、GSE104948、GSE99340 筛选后分别确定了170 个、347 个、80 个、182 个、295 个与IgAN 相关的差异基因，合并后为723 个。

2.2 HBHGT 成分和靶点筛选结果

通过数据库及相关文献共获得114 个化学成分，筛选后得到HBHGT 的活性成分共15 个（见表1），通过SwissTargetPrediction 数据库共获得1010个潜在靶点，去重后得到511 个潜在靶点。

表1 火把花根片主要成分

续表1

2.3 疾病靶点数据库建立

获得与IgAN 相关的靶点基因1326 个，与从GEO数据库获得的723 个差异基因取交集进行验证，获得402 个疾病靶点。

2.4 HBHGT 药物-成分-靶点网络图构建

取交集后得到HBHGT 治疗IgAN 的潜在靶点108 个（见图1）。 运用Cytoscape 3.8.0 构建HBHGT治疗IgAN 的药物-成分-靶点网络图（见图2）。通过NetworkAnalyzer 分析成分网络节点特征参数，预测HBHGT 治疗IgAN 的主要成分（见表2）。

表2 火把花根片成分部分网络节点特征参数

图1 HBHGRT-IgAN 靶点韦恩图

图2 HBHGT 治疗IgAN 的药物-成分-靶点网络图

2.5 核心靶点筛选及PPI 网络构建

将二者交集靶点在STRING 11.0 数据库进行PPI 网络分析，结果为靶点108 个，靶点之间相互关系973 条。 利用CytoNCA 插件对网络参数进行计算，以DC≥17（中位数）、BC≥0.001 032 69（中位数）、CC≥0.135 732 4（中位数）为条件进行筛选，筛选后得靶点54 个，靶点间相互关系331 条，并用Cytoscape 3.8.0 可视化呈现（见图3）。其中，DC 值排名靠前的靶点白细胞介素-6（interleukin-6, IL-6）、纤维连接蛋白1(fibronectin1, FN1)、白蛋白（albumin,ALB）细胞肿瘤抗原p53（cellular tumor antigen p53,TP53）、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)、Toll 样受体(toll-like receptor, TLR)、血管内皮细胞生长因子A(Vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、丝裂原活化蛋白激酶3（mitogen activated protein kinase 3, MAPK3）等，即为HBHGT 治疗IgAN的可能潜在作用靶点。

图3 HBHGT 治疗IgAN 的核心靶点

2.6 数据分析

将HBHGT 治疗IgAN 的54 个靶点录入DAVID数据库进行富集分析，包括GO 的生物学过程（biological process, BP）、细胞组成（cellular component,CC）和分子功能(molecular function, MF）分析和KEGG 通路富集分析（见图4）。 在细胞组成上富集到了42 个项目，涉及细胞器、质膜、细胞质、线粒体外膜等方面；在分子功能上富集到55 个项目，主要与酶结合、蛋白结合、细胞因子活性等有关；参与了128 种生物过程，主要涉及代谢调控、蛋白质磷酸化、上皮细胞增殖和凋亡等方面；主要通路有核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)信号通路、TNF 信号通路、 血管内皮细胞生长因子(vascular endothe lial growth factor, VEGF) 信号通路、PI3K-Akt 信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase, MAPK）信号通路、TLR信号通路、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路等。

图4 HBHGT 治疗IgAN 核心靶点的富集分析

2.7 分子对接验证

利用AutoDock 软件将排名前6 的化合物（雷公藤红素、雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、没食子酸、雷酚内脂、雷公藤乙素），与8 种排名靠前的核心靶点(IL6、FN1、ALB、TP53、TNF、TLR、VEGFA、MAPK3)逐一对接，对接结果只取最高绝对值。 用R 4.1.2 绘制热图（见图5），结合能绝对值越大表明靶点与活性成分之间的对接结果越好。 同时，借助Pymol 2.5.0 软件分别对分值较高的组合进行结合模式分析，详见图6。

图5 HBHGT 中的关键化合物与PPI 核心靶蛋白分子对接Docking Score 值热图

图6 HBHGT 关键化合物与核心靶点对接模型及位点图

3 讨论

火把花根即中药昆明山海棠根，有祛风除湿、活血止血、舒筋接骨、解毒杀虫等功效。 现代临床研究表明，其成分具有抗炎、免疫抑制、抗肿瘤等作用[18]。李夏玉等[11]对HBHGT 治疗的60 例IgAN 病例进行观察，结果显示其有效率为75%，与雷公藤多苷片相比，具有“低毒”的优势；于梅等[19]发现益肾汤加HBHGT 疗效与IgAN 病理类型有关, 病理损害越重疗效越差， 且疗效较单用其中一种治疗IgAN 疗效明显，并且见效快，可减少复发。王坤明等[10]研究表明，采用HBHGT 结合西医治疗在减少24 h 尿蛋白定量和尿红细胞计数方面优于单纯西医疗法，HBHGT 治疗IgAN 有效，并具有免疫抑制作用。

在本研究中，通过TCMSP、本草组鉴、BATMANTCM3 个中药数据库及相关文献， 利用Linpinski五规则筛选后得出15 种成分。其中，4 种成分（雷公藤红素、雷公藤甲素、雷酚内酯，雷公藤内脂酮）在实验中进行了测试。为了探究HBHGT 治疗IgAN 的内在机制，应用DAVID 平台进行GO 注释。 GO 分析表明，HBHGT 治疗IgAN 在分子功能方面，主要涉及酶结合、蛋白结合、细胞因子活性等方面的调节，如细胞因子活性、蛋白磷酸酶结合、蛋白激酶结合、蛋白激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性等；在细胞组成方面，涉及细胞器、质膜、细胞质、线粒体外膜等方面；在生物学过程方面，主要涉及代谢调控和蛋白质磷酸化、上皮细胞增殖和凋亡等方面，如细胞增殖、凋亡过程、蛋白质磷酸化、活性氧代谢等。

FN1 是一种黏附的高分子量二聚糖蛋白，是细胞外基质的一部分。 不同的FN1 变体在二聚体分泌、血液凝固、黏附淋巴细胞、皮肤伤口愈合、动脉粥样硬化和肝纤维化中起特定作用[20]。有研究表明，纤维连接蛋白肾病（glomerulopathy with fibronectin deposits, GFND）伴有大量FN1 肾小球沉积，导致终末期肾衰竭[21]。 此外，尿FN1 排泄可能是IgAN 中疾病活动度的标志物[22]。原发性IgAN 患者的血清中存在IgA-FN1 复合物，IgA 抗体与胶原Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ结合需要通过FN1 结合位点来介导[23]。 ALB 是血管内主要的抗氧化剂，实验表明，ALB 预处理的小鼠系膜细胞和人肾细胞中过氧化氢诱导的细胞内活性氧和线粒体损伤明显减轻，ALB 的抗氧化能力可以减少氧化应激的发生，从而延缓IgAN 的进程[24]。

TLR 是哺乳动物固有免疫系统的关键组成部分，通过结合病原相关分子模式（pathogen associated molecular pattern, PAMP）和/或损伤相关分子模式（damage associated molecular pattern, DAMP）介导免疫和炎症反应[25]，SMITH[26]印证了TLR 与IgA的发病有关。 干扰素、TNF 和特异性白细胞介素由TLR 诱导。 例如，TNF-α、IL-6、IL-23 和IL-10 的表达是由TLR4 激活诱导的[27]。 IL-6、信号转导子和转录激活子3（activator of transcription 3, STAT3）以及NF-κB 通路与TLR2 刺激的IL-17 和IL-23 有关[28]。NF-κB 信号通路控制一系列基因的表达（如TNFα、IL-6 的产生），在控制炎症和免疫反应的过程中扮演关键角色[29-30]。

Tp53 在调节细胞代谢的不同方面（包括自噬）中起着关键作用。 在正常生理条件下，Tp53 可以抑制自噬体的形成，但应激条件也可以导致Tp53 介导的自噬促进，在营养耗尽或缺氧等压力条件下，Tp53 通过抑制mTOR 信号传导促进自噬激活[31]。VEGFA 对血管内皮细胞的增殖和分化影响最大，是最主要的VEGF。 VEGF 可以增加血管通透性，参与肾脏血管生成。 研究发现，VEGF 在活动性IgAN 组织的上皮细胞和炎性细胞中表达明显增加，推测VEGF 在活动性炎性组织中表达增强，影响微循环，加重黏膜缺氧损伤[32-33]。有研究表明，IgAN 患者血清中TNF-α 和IL-6 水平明显升高[34]。TNF-α 是细胞凋亡、免疫和炎症的主要介质，通过与TNF 受体（TNFR-Ⅰ和TNFR-Ⅱ）结合来传递其信号[27]。

IgA 的异常糖基化是IgAN 发病机制的核心。IgAN患者的肾小球IgA 仅限于IgA1 亚类，例如：半乳糖缺乏性IgA1（galactose-deficient IgA1, Gd-IgA1）[35-36]。IgA1在IgAN 的发生发展中起着至关重要的作用，通过TLR9 的先天性免疫激活参与Gd-IgA1 的产生。增殖诱导配体（a proliferation inducing ligand, APRIL）和IL-6 也可增强IgAN 中Gd-IgA1 的合成[37]。此外，IgAN 患者血清中Gd-IgA1 和含有Gd-IgA1 特异性自身抗体的免疫复合物水平升高[38-39]。 IL-6 和IL-4增加IgA1 的产生，并加重了半乳糖缺乏的程度，增加IgAN 患者分泌IgA1 的细胞系合成Gd-IgA1[40]。 这些也再次说明，IL-6 可能是这一过程的关键介体。

有动物实验表明，雷公藤红素能够抑制肾脏氧化应激和炎症，降低尿白蛋白排泄和改善糖尿病小鼠的肾脏功能，降低IL-6 和TNF-α 的表达[41]。 通过抑制NF-κB 信号激活，抑制肾小管细胞凋亡，从而改善肾脏的炎症损伤，改善细胞凋亡[42-43]。 雷公藤红素可以通过抑制p38 MAPK 表达和NF-κB p65 降低血肌酐和尿素氮含量，降低糖尿病大鼠尿蛋白的排泄，改善肾脏的病理损伤，调节信号通路MAPK/NF-κB，抑制炎症和延缓肾功能损伤，保护糖尿病大鼠的肾脏[44]。 作为一个潜在的治疗药物，也可以通过PI3K/AKT 途径减弱肾损伤，抑制肾小球基底膜增厚和足细胞凋亡[45]。这些结果都证实，雷公藤红素的抗炎效果。

雷公藤甲素具有抗炎、抗增殖、免疫抑制和抗肿瘤等多种生物学活性[46-48]。 HE 等[49]从IgAN 大鼠的实验中观察到，雷公藤甲素可显著降低血清IL-1β和IL-18 水平，并可能通过下调NLRP3 和TLR4 的表达，改善炎症小体介导的促炎细胞因子的产生来发挥抗炎作用，阻止IgAN 的进展，显著减弱大鼠肾系膜增生和系膜扩张以及肾小球IgA 沉积。 雷公藤甲素可通过减少TNF-α 的表达来发挥抗炎作用[50]。TAO 等[51]实验研究发现，通过雷酚内酯治疗的小鼠与溶媒组的小鼠相比，蛋白尿和尿素氮水平显著降低，在44 周龄时，溶媒组小鼠的存活率明显低于用雷公藤甲素或雷酚内酯治疗的小鼠。

雷公藤内酯酮具有抗炎及免疫抑制作用。张建伟等[52]证实大剂量的雷公藤内酯酮对T 细胞增殖反应有一定的免疫抑制作用，对B 细胞的免疫功能有促进作用。同时有基础研究表明，其可显著降低CIA大鼠脾细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6 水平，有效抑制小鼠腹腔巨噬细胞分泌的NO 和TNF-α[53-54]。

本研究借助基因分析、网络药理学以及分子对接平台，对药物与疾病进行关联分析，初步预测了HBHGT 在IgAN 治疗中起关键作用的药物成分、靶点、通路及其潜在作用机制，为IgAN 的临床治疗以及用药提供了参考。 但仍有部分成分-靶点-通路信息缺乏，因此，还需要更高质量的生物信息学及网络药理信息平台来提供支撑，需要更多的细胞或动物实验来给予验证和支持。