天名精总倍半萜内酯在大鼠体内的药代动力学研究

姚思凡，陈迪路，张 艺，周小江，2*

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；湖南省中药饮片标准化及功能工程技术研究中心，湖南 长沙 410208）

天名精（Carpesium abrotanoides L）为菊科天名精属草本植物，又称鹤虱草、活鹿草、天门精、玉门精等。广泛生长于路边、溪边和山坡，分布于我国西南、华中、华南等地区[1]。 天名精始载于《神农本草经》，被列为上品。其性辛凉，味苦，有小毒，具有驱虫的功效[2-3]，《本草纲目·草部》曾记载：“久服身轻耐老”[4]。现收录于2009 版《湖南省中药材标准》，用于治疗咽喉肿痛，蛔虫病、蛲虫病等虫积腹痛，在苗族、土家族等少数民族被广泛应用[5]。

在前期药效学和毒理学试验中，本课题组证明了天名精总倍半萜内酯提取物具有较好的抗癌和抗流感病毒作用，同时毒副作用小[6]。研究表明，天名精总倍半萜内酯具有抗甲型H1N1 流感病毒的药理作用，其中11(13)-二氢特勒内酯、特勒内酯、天名精内酯酮为其主要活性成分，具有抗炎、抗菌、抗病毒等广泛的药理活性[7-10]。 但是目前尚无关于天名精总倍半萜内酯相关成分的药代动力学研究的报道。 本文对天名精总倍半萜内酯进行药代动力学研究，以期解释3 种天名精总倍半萜内酯在动物体内的代谢规律，进一步为天名精总倍半萜内酯提取物抗甲型H1N1 流感病毒药物的开发奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 主要仪器与试剂

LC-16 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；As3120型超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；CP214 型分析天平（美国奥豪斯公司）；SorvaLL ST 8R 型高速离心机（美国赛默飞公司）；HSC-24A型氮气吹干仪（天津恒奥科技有限公司）；QL-866 型涡旋振荡器（海门市其林贝尔公司）。 怡宝水（华润集团，批号：60220010265)；乙腈（色谱纯，批号：20145210）、甲醇（色谱纯，批号：32157560）均购自美国天地公司；乙酸乙酯（分析纯，国药集团，批号：20191013）。

1.2 试药

供试品：天名精总倍半萜内酯，自制。对照品：11(13)-二氢特勒内酯、特勒内酯和天名精内酯酮均为自制，经1D-和2D-NMR 分析，同时参考文献数据[11-14]确定结构，并经HPLC 峰面积归一化法检测，纯度均大于97%。

1.3 实验动物

健康清洁级雄性SD 大鼠（270±10） g。 购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，由湖南中医药大学实验动物中心饲养[许可证号：SYXK（湘）2013-005]。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：WondaSiL C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈-水（29.5∶70.5）；流速：1.0 mL/min；检测波长：211 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。 在该色谱条件下，11(13)-二氢特勒内酯、特勒内酯、天名精内酯酮的色谱峰理论塔板数均大于4000，各个色谱峰与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，符合要求。

2.2 母液配置

精密称取干燥至恒重的11(13)-二氢特勒内酯、特勒内酯和天名精内酯酮适量，分别置于25 mL 容量瓶中，加入甲醇，分别配置成浓度为44、40、40 μg/mL的对照品溶液。 置于4 ℃冰箱中避光保存，备用。

2.3 血浆样品处理

精密移取血浆100 μL，置于1.5 mL EP 管中，加入500 μL 乙酸乙酯，涡旋混匀3 min，在4 ℃、10 000 r/min 条件下高速离心10 min（离心半径6 cm），取上清液于1.5 mL EP 管中，重复萃取2 次，合并2次的乙酸乙酯萃取液，加入4 倍量乙腈沉淀蛋白，涡旋混匀30 s，于40 ℃水浴下氮气吹干，残渣加入100 μL 流动相涡旋振荡溶解，在4 ℃，10 000 r/min条件下高速离心10 min（离心半径6 cm），取上清液20 μL 进样。

2.4 方法学考察[15-17]

2.4.1 专属性实验 分别移取100 μL 空白血浆、加入25%羟丙基-β-环糊精的100 μL 阴性对照、加入天名精总倍半萜内酯提取物的100 μL 空白血浆、100 μL 给药后大鼠血浆，按照“2.3”项下方法处理样品后，按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果表明，血浆中内源性物质和25%羟丙基-β-环糊精不干扰天名精总倍半萜内酯中3 种主成分的测定，且3 种主成分的色谱峰峰型良好。 保留时间分别为43.3、46.5、50.8 min，详见图1。

图1 专属性色谱图

2.4.2 标准曲线的制备 精密量取“2.2”项下配制的11(13)-二氢特勒内酯、特勒内酯、天名精内酯酮各8 mL，溶于25 mL 容量瓶中，加甲醇适量定容，得到3 种主成分的混标母液，混匀备用。移取混标母液，配置成系列浓度的混合对照品溶液。 取各浓度混合标准品溶液各20 μL，加入100 μL 空白血浆，配制成相应的系列质量浓度含药血浆样品，按照“2.3”项下方法处理样品，再以各主成分相应的峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归，得各成分的回归方程：11(13)-二氢特勒内酯为Y=25 909X-527.53，R2=0.993；特勒内酯为Y=29 787X+493.56，R2=0.995；天名精内酯酮为Y=28 107X-2026，R2=0.991。 详见图2。

图2 3 种天名精总倍半萜内酯的标准曲线

结果表明，在此色谱条件下，特勒内酯、11（13）-二氢特勒内酯在浓度为0.031～12.8 μg/mL 范围内线性关系良好。 天名精内酯酮在浓度为0.034～14.1 μg/mL范围内线性关系良好。

2.4.3 精密度实验 取混标母液及大鼠空白血浆100 μL，分别配制低、中、高3 个质量浓度的血浆对照品溶液：11(13)-二氢特勒内酯(0.64、0.64、0.70 μg/mL)、特勒内酯(1.60、1.60、1.76 μg/mL)、天名精内酯酮(6.40、6.40、7.04 μg/mL)，每个浓度平行配制5 份。将血浆按照“2.3”项下方法处理后，取上清液进行色谱分析，测定血浆中3 种天名精总倍半萜内酯成分。按照标准曲线法计算质量浓度，计算日内精密度；连续3 d 重复上述操作，计算日间精密度。 详见表1。

结果显示，上述方法测得的日内RSD、日间RSD和相对回收率均小于15%，符合生物分析方法指导原则的要求。

2.4.4 回收率实验 取大鼠空白血浆加入混标母液，分别配制低、中、高3 个不同质量浓度的血浆标准品溶液，每个质量浓度平行配制5 份。 按照“2.3”项下的方法处理血浆样品后检测，记录目标峰的峰面积为血浆标准峰面积。 另取3 支EP 管，每组取一支加入与配制血浆对照品溶液相同的对照品溶液，40 °C 氮气吹干后用100 μL 流动相复溶，取20 μL上清液进液相检测；记录低、中、高3 种不同浓度下目标化合物的峰面积为对照品的峰面积。 计算血浆中样品与标准品的峰面积比值，即为绝对回收率。详见表1。

表1 精密度和回收率考察结果

结果显示，RSD 均小于15%，符合生物样品定量分析方法指导原则的要求。

2.4.5 样品稳定性测定 分别配制低、中、高3 个质量浓度的血浆对照品溶液，每个浓度平行配制5 份。取低、中、高3 个质量浓度的血浆样品按“2.3”项下方法处理，取0、12、24、48 h 的样品上清液注入高效液相色谱仪中进行分析，测定血浆中目标化合物的峰面积，考察室温条件下放置48 h 血浆样品的稳定性。结果显示低、中、高3 个质量浓度的血浆样品中，11(13)-二氢特勒内酯RSD 分别为6.02%、3.15%、5.20%；特勒内酯RSD 分别为4.05%、1.61%、5.76%；天名精内酯酮RSD 分别为4.59%、3.54%、5.73%。

取低、中、高3 种不同浓度的血浆质控样品，反复冻融3 个循环，测定血浆样品从-80 ℃至室温条件下冻融3 个循环的稳定性。 低、中、高3 个不同浓度血浆质控样品中11(13)-二氢特勒内酯的RSD 分别为3.46%、4.38%、5.76%；特勒内酯的RSD 分别为6.71%、5.81%、1.78%；天名精内酯酮RSD 分别为8.95%、3.18%、1.79%。

取低、中、高3 个不同浓度的血浆质控样品，考察样品在-80 ℃条件下冻存7 d 的稳定性。 3 个质量浓度质控样品中11(13)-二氢特勒内酯的RSD 分别为6.11%、2.55%、4.07%；特勒内酯的RSD 分别为7.03%、7.74%、2.46%；天名精内酯酮RSD 分别为7.71%、6.18%、1.43%。 详见表2。

表2 样品稳定性考察

实验结果表明，天名精总倍半萜内酯血浆样品稳定性RSD 均小于10%，说明天名精总倍半萜内酯血浆样品在以上3 种情况下基本稳定。

2.5 大鼠体内的药代动力学实验

用50 μL 乙醇溶解样品后，以25%的羟丙基-β-环糊精为溶剂，制备质量浓度为10 mg/mL 的天名精总倍半萜内酯药液，超声使其完全溶解。选取9只健康雄性SD 大鼠，通过尾静脉注射给药，剂量为50 mg/kg。 给药后5、10、15、20、30、45 min 及1、1.5、2、3、4、6、8 h 通过眼底静脉丛取血约0.5 mL，将采集的全血收集于肝素抗凝管中，以4000 r/min 的速度离心15 min（离心半径6 cm），吸取上层血浆。 按照“2.3”项下方法处理大鼠血浆样品，按照“2.1”项下条件进样，进行高效液相色谱分析，记录色谱峰面积并按标准曲线计算药物质量浓度。 对于计算求得的血药浓度，使用软件DAS 2.0 进行药代动力学拟合计算，获得天名精总倍半萜内酯3 种主要成分给药后药时曲线与相关药代动力学参数。

分析主要药代动力学参数并结合药时曲线可知，天名精总倍半萜内酯3 种成分单次尾静脉给药后，体内药代动力学过程中11(13)-二氢特勒内酯、特勒内酯符合三室模型，天名精内酯酮符合二室模型。 给药后，11(13)-二氢特勒内酯、特勒内酯、天名精内酯酮的血药质量浓度迅速达到最大值，分别为3.843、9.076、2.060 μg/mL；曲线下面积AUC（0～T）分别为145.564、262.401、98.086 min/(μg·mL)；药物半衰期t1/2为15.835、62.318、41.843 min；血浆清除率CLz为0.183、0.145、0.311 L/(min·kg)，结果见图3 和表3。利用DAS 2.0 软件对测得的血药浓度数据进行房室模型拟合。

表3 天名精总倍半萜内酯的药代动力学参数

图3 天名精总倍半萜内酯的药时曲线

3 讨论

中药药代动力学是借用化学药物代谢动力学研究手段，研究中药活性成分、组分、单味中药和复方在机体内的过程及其动态变化规律，以探讨中药的药效物质基础、中药组分的相互作用、中药配伍机制和中药炮制机制等科学问题[18]。本实验建立了HPLC测定大鼠尾静脉注射天名精总倍半萜内酯后的多指标成分的药代动力学实验方法。通过方法学验证，此方法可快速、灵敏、准确地同时测定11(13)-二氢特勒内酯、特勒内酯、天名精内酯酮3 种成分，测定结果均符合现行生物分析方法的相关规定[19-20]。

在给药前选择溶解天名精总倍半萜内酯方法时，因其溶解度不佳，先后对比了DMSO、乙醇、β-环糊精、吐温80、羧甲基纤维素钠、聚乙二醇等表面活性剂，在查阅文献及实验后选择了用乙醇溶解样品，加入25%羟丙基-β-环糊精作为表面活性剂，增加了天名精总倍半萜内酯的溶解度，可用于下一步的尾静脉注射给药[21]。 在选择血浆样品预处理方法时，本实验先后对比了蛋白沉淀法和液液萃取法，液液萃取法所选择的溶剂为乙酸乙酯、三氯甲烷、丙酮等试剂，蛋白沉淀法所选择的溶剂为甲醇和乙腈。 通过计算提取回收率，发现先用乙酸乙酯萃取后用乙腈沉淀蛋白为天名精总倍半萜内酯血浆药代动力学中最佳的样品处理方法。

综上所述，本研究建立了HPLC 测定大鼠尾静脉注射天名精总倍半萜内酯后的多指标成分的药代动力学实验方法，首次研究了天名精总倍半萜内酯静脉给药后在大鼠体内的代谢规律，为天名精总倍半萜内酯临床用药提供了相关药代动力学数据支持，完善了湘产中药材天名精的研究，为天名精总倍半萜内酯的抗甲型H1N1 流感病毒的中药新药研发提供了相关数据支持，为天名精总倍半萜内酯的临床应用奠定基础，对进一步开发利用湘产中药材天名精具有重大意义。