基于OPG/RANK/RANKL 信号通路探究益肾健骨颗粒对绝经后骨质疏松大鼠BMSCs 成骨分化的影响

刘 勇，易振宇，张信成

（1.湖南省中西医结合医院医保科，湖南 长沙 410006；2.湖南省中西医结合医院脊柱骨肿瘤科，湖南 长沙 410006；3.湖南省中西医结合医院创伤关节科，湖南 长沙 410006）

骨质疏松症主要表现为骨量减少、骨微结构破坏，可增加骨折风险，多发于老年人，在绝经后的女性中发病率高达50%，雌激素替代疗法为治疗骨质疏松症的有效措施，但是长期使用可增加乳腺癌的风险[1-2]。 益肾健骨颗粒具有补益肝肾、益气养血、化瘀通络的作用，对芳香化酶抑制剂相关的肌肉骨骼症状具有良好的改善作用[3]。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）可分化为成骨细胞，在维持骨的重建过程中发挥重要作用[4]。 研究显示，健骨颗粒可以调低miR-141 的表达，促进BMSCs 成骨分化[5]。 骨保护素（osteoprotegerin，OPG）/核因子κB 受体活化因子（receptor activator of nuclear factor-kappa B, RANK）/RANK 配体（RANK ligand, RANKL）信号通路在骨吸收与骨形成过程中发挥调控作用，激活OPG/RANKL/RANK 信号通路可抑制破骨细胞的分化和成熟，促进BMSCs细胞成骨分化[6]。 因此，本研究探索肾健骨颗粒对绝经后骨质疏松大鼠BMSCs 成骨分化及OPG/RANK/RANKL 信号通路的影响，以期阐明其作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF 级SD 雌性未受孕大鼠（7～8 周龄），体质量（200±20） g，购自广州中医药大学[生产许可证号：SCXK（粤）2019-0047]。

1.2 主要材料

益肾健骨颗粒（批号：20210320，湖南省中医药研究院制剂室）；β-磷酸甘油钠（批号：G9422）、地塞米松磷酸钠注射液（批号：D1576）、茜素红S（批号：A5533）均购自美国Sigma 公司；OPG 小干扰RNA（small interfering RNA-OPG, si-OPG，批号：Z190301）、小干扰RNA 阴性对照（small interfering RNA negative control, si-NC，批号：A20210324）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP，批号：202104085）、Runt 相关转录因子2（Runt-associated transcription factor 2,Runx2，批号：202006011）、骨钙素（osteocalcin, OCN，批号：H20210816）引物均购自广州锐博生物科技有限公司；反转录第一链cDNA 合成试剂盒（批号：K1622，美国Thermo Fisher 公司）；通用型荧光定量试剂盒（批号：04913914001，美国Roche 公司）；5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐（5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate, BCIP）/四唑硝基蓝（nitro blue tetrazolium chloride monohydrate, NBT）碱性磷酸酯酶显色试剂盒（批号：C3206）及ALP 活性试剂盒（批号：P0321M）均购自碧云天生物科技有限公司；OPG（sc-390518）、RANK（批号：sc-59981）、RANKL（批号：sc-52950）抗体均购自美国Santa cruz 公司；异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）荧光标记抗体CD29-FITC（批号：ab21845）、藻红蛋白（phycoerythrin,PE）标记的CD44-PE（批号：ab23396）、CD45-FITC（批号：ab33916）和CD34-PE（批号：ab223930）抗体均购自美国Abcam 公司。 凝胶成像系统（型号：FluorChem HD2， 美国自然基因科技有限公司）；流式细胞仪（型号：CytoFLEX， 美国贝克曼库尔特公司）；相差显微镜（型号：CX23，日本奥林巴斯公司）。

1.3 方法

1.3.1 含药血清制备 给予大鼠益肾健骨颗粒灌胃，根据大鼠与人药物计量换算关系，大鼠每日用量为140 mg，溶解于0.5 mL 生理盐水。 另取大鼠给予不含药的生理盐水0.5 mL 灌胃。 所有大鼠均给药1周，给药结束后，腹主动脉采全血后，1500 r/min，离心半径10 cm，离心10 min 取上清液并过滤除菌，分别获得益肾健骨颗粒含药血清及正常血清，置于-20 ℃冰箱冷冻备用。

1.3.2 BMSCs 细胞分离与鉴定 参照文献[7]中的方法，采用背侧双切口切除双侧卵巢建立绝经后骨质疏松模型，术后1 d 开始各组每日注射青霉素（2.0×105 IU/kg），共3 d。造模12 周后，用microCT 股骨远端扫描及检测体质量，当骨密度，骨体积分数、骨小梁数量等数值较正常显著降低时，提示造模成功[8]。

造模成功后断颈处死大鼠，无菌条件分离股骨和胫骨，去两端骨骺暴露骨髓腔，使用注射器注射α-MEM 培养基反复吹打骨髓腔，收集细胞并过滤，接种至培养瓶中常规传代培养，每隔3 d 换液，取第3 代BMSCs 用于后续实验，倒置相差显微镜观察细胞形态。

流式细胞术鉴定BMSCs 表面标志物：收集细胞液，1000 r/min，离心半径10 cm，离心5 min 收集细胞沉淀，PBS 洗涤并重悬，加入CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-PE-Cy5.5 和CD34-PE 抗体，避光孵育，流式细胞仪检测。

1.3.3 BMSCs 细胞分组及成骨分化诱导 第3 代BMSCs 制备成1×104/mL 的细胞悬液，接种于6 孔板中，将细胞分为对照组（N 组）、含药血清组（J 组）、含药血清+si-NC 组（J+C 组）、含药血清+si-OPG 组（J+O 组），每组6 个复孔。J+C 组、J+O 组细胞分别转染si-NC、si-OPG 质粒。 转染48 h 后，N 组培养液加入正常血清，其余组培养液中均加入益肾健骨颗粒含药血清。 待细胞融合至约90%时，进行成骨分化诱导培养，使用α-MEM 培养基（含有10% FBS、10 μmol/Lβ-磷酸甘油、10 μmol/L 地塞米松、50 μmol/L维生素C）进行诱导培养，每隔3 d 换成骨分化诱导培养基。

1.3.4 ALP 染色 成骨分化诱导7 d 后，弃去培养液，于4%多聚甲醛中固定15 min，加入BCIP/NBT碱性磷酸酯酶染色液，避光染色30 min，观察染色情况。 另收集细胞，使用ALP 检测试剂盒检测ALP活性。

1.3.5 茜素红S 染色 BMSCs 成骨诱导28 d 后，弃去培养液加入4%多聚甲醛固定30 min， 加入0.2%茜素红S 染色液染色30 min，蒸馏水冲洗多余液体，待细胞干燥后，倒置相差显微镜观察并拍照，随机选取5 个视野，计算矿化结节数。

1.3.6 RT-qPCR 实验检测ALP、Runx2、OCN mRNA表达 收集各组BMSCs 细胞，加入Trizol 试剂提取中总RNA，使用反转录试剂盒反转录合成cDNA，PCR 扩增检测ALP、Runx2、OCN mRNA 相对表达量。 ALP 正向引物为TGGTACTCGGACAATGAGATGC，反向引物为GCTCTTCCAAATGCTGATGAGGT；Runx2 正向引物为CCTCTGACTTCTGCCTCTGG，反向引物为GATGAAATGCTGGGAACTG；OCN 正向引物为GGGCTCCAAGTCCATTGTT，反向引物为ACCCGAATGTTGAGCGAGAG。 以β-ation 为内参，采用2-△△Ct法计算各基因相对表达量。

1.3.7 Western blot 检测OPG、RANK、RANKL 蛋白表达 BMSCs 成骨诱导培养7 d 后，离心收集各组细胞加入RIPA 裂解液裂解细胞，离心收集上清液，BCA 法检测蛋白浓度，取40 μg 蛋白加上样缓冲液煮沸变性后，进行SDS-PAGE 分离蛋白并转膜，分别加入稀释后的OPG、RANK、RANKL 抗体和βactin 抗体，4 ℃摇床过夜，加入相应二抗37 ℃孵育1 h，加入增强ECL 化学发光液显色，FluorChem HD2 凝胶成像系统成像，以β-actin 为内参，Image J软件分析蛋白表达。

1.4 统计学方法

采用SPSS 25.0 进行统计分析。 计量资料符合正态分布及方差齐检验，用“±s”描述，多组间比较行单因素方差分析，组间两两比较行SNK-q 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMSCs 形态观察、鉴定

成功分离BMSCs 细胞，大鼠第1 代细胞培养24 h后，贴壁细胞形态不一，呈现长梭形，培养至第3 代细胞时，细胞铺满瓶底呈梭形，且形态均一，排列紧密呈放射状或旋涡状。 详见图1。

图1 显微镜下观察BMSCs 形态

流式细胞术检测BMSCs 细胞显示：CD29（97.34%）、CD44（98.35%）呈阳性表达，CD45（1.85%）、CD34（2.34%）呈阴性表达。 详见图2。

图2 BMSCs 的流式细胞仪分析

2.2 益肾健骨颗粒对BMSCs ALP 的影响

成骨分化诱导7 d 后，ALP 染色阳性为蓝黑色。 与N 组比较，J 组与J+C 组染色加深，ALP 活性明显升高（P＜0.05）。 与J 组、J+C 组比较，J+O 组ALP染色变浅，ALP 活性明显降低（P＜0.05）。 详见表1、图3。

图3 各组BMSCs 的ALP 染色（×200）

表1 益肾健骨颗粒对BMSCs ALP 活性的影响（±s，n=6）

表1 益肾健骨颗粒对BMSCs ALP 活性的影响（±s，n=6）

注：与N 组相比，*P＜0.05；与J+C 组相比，#P＜0.05；与J 组相比，&P＜0.05。

组别N 组J 组J+C 组J+O 组ALP/（U·L-1）278.26±21.64 426.51±30.29*435.62±28.46*383.47±24.32#&

2.3 益肾健骨颗粒对BMSCs 成骨分化矿化结节的影响

诱导成骨分化28 d 行茜素红染色，矿化结节被染成红色。 J 组、J+C 组较N 组矿化结节数显著增加（P＜0.05），J+O 组较J 组、J+C 组矿化结节数显著减少（P＜0.05）。 详见图4、表2。

图4 各组BMSCs 成骨分化的茜素红染色（×200）

表2 益肾健骨颗粒对BMSCs 成骨分化矿化结节的影响（±s，n=6）

表2 益肾健骨颗粒对BMSCs 成骨分化矿化结节的影响（±s，n=6）

注：与N 组相比，*P＜0.05；与J+C 组相比，#P＜0.05；与J 组相比，&P＜0.05。

组别N 组J 组J+C 组J+O 组矿化结节数/个6.53±1.13 15.43±2.76*14.90±2.95*9.53±1.78#&

2.4 益肾健骨颗粒对BMSCs 成骨分化相关基因mRNA 表达的影响

与N 组比较，J 组与J+C 组ALP、Runx2、OCN mRNA 表达水平显著升高（P＜0.05）。 与J 组、J+C 组比较，J+O 组ALP、Runx2、OCN mRNA 表达水平显著降低（P＜0.05）。 详见表3。

表3 益肾健骨颗粒对BMSCs 细胞成骨分化相关基因表达的影响（±s，n=6）

表3 益肾健骨颗粒对BMSCs 细胞成骨分化相关基因表达的影响（±s，n=6）

注：与N 组相比，*P＜0.05；与J+C 组相比，#P＜0.05；与J 组相比，&P＜0.05。

组别N 组J 组J+C 组J+O 组ALP 1.05±0.06 1.67±0.10*1.63±0.09*1.26±0.07#Runx2 1.03±0.07 1.52±0.14*1.53±0.15*1.39±0.10#OCN 0.93±0.08 1.45±0.11*1.50±0.12*1.32±0.09#&

2.5 益肾健骨颗粒对BMSCs 蛋白OPG、RANK、RANKL 表达的影响

与N 组比较，J 组与J+C 组OPG 表达水平显著升高（P＜0.05），RANK、RANKL 表达水平显著降低（P＜0.05）。 与J 组、J+C 组比较，J+O 组OPG 表达水平显著降低（P＜0.05），RANK、RANKL 表达水平显著升高（P＜0.05）。 详见图5、表4。

图5 Western blot 检测各组BMSCs 蛋白OPG、RANK、RANKL 表达

表4 各组细胞OPG、RANK、RANKL 蛋白表达比较（±s，n=6）

表4 各组细胞OPG、RANK、RANKL 蛋白表达比较（±s，n=6）

注：与N 组相比，*P＜0.05；与J+C 组相比，#P＜0.05；与J 组相比，&P＜0.05。

组别N 组J 组J+C 组J+O 组OPG 0.62±0.08 1.01±0.11*1.03±0.12*0.56±0.09#RANK 0.97±0.11 0.63±0.07*0.65±0.08*0.83±0.06#RANKL 1.05±0.12 0.51±0.07*0.53±0.06*0.75±0.08#&

3 讨论

BMSCs 在一定的条件下可向软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞等分化，BMSCs 在成骨诱导条件下，向成骨细胞分化，促进BMSCs 成骨分化是治疗与预防骨质疏松症的有效策略[9-10]。 目前， 促进BMSCs 成骨分化的报道有很多，中药提取物如补骨脂素可诱导BMSCs 成骨分化[11]。 另有研究显示，固本增骨方（炙黄芪、当归、烫狗脊）含药血清可促进BMSCs 的增殖，并诱导其成骨分化[12]。中医学认为骨质疏松症是脾虚、肾亏等引起的，益肾健骨颗粒主要由千年健、红花、砂仁、熟地黄等构成，方中千年健有强筋止痛功效，红花、丹参具有益气活血的作用，淫羊藿有活血补肾的作用，熟地黄可以强筋健骨，诸药合用可以强筋健骨、补肾健脾之功效[13-14]。 本研究建立绝经后骨质疏松大鼠模型，经前期研究，灌胃给药益肾健骨颗粒可改善大鼠的骨质疏松症，但其具体作用机制尚不清楚。

本研究建立绝经后骨质疏松大鼠模型，成功分离大鼠的BMSCs 细胞，经观察细胞形态与鉴定细胞表面标志物，与相关报道[15]一致。 本研究BMSCs 细胞使用益肾健骨颗粒含药血清培养后，经成骨分化诱导培养7 d 后，ALP 染色加深，ALP 活性明显升高（P<0.05），诱导成骨分化28 d 行茜素红染色显示矿化结节数显著升高（P<0.05），提示益肾健骨颗粒可能具有促进BMSCs 细胞成骨分化的作用。 Runx2是成骨过程中最重要的转录因子，调控间充质干细胞向成骨细胞分化；OCN 为钙结合蛋白，参与骨钙代谢，可反映骨形成[16-17]。本研究RT-qPCR 检测ALP、Runx2、OCN mRNA 表达显示，J 组ALP、Runx2、OCN mRNA表达水平显著升高（P<0.05），证实益肾健骨颗粒有促进BMSCs 细胞成骨分化的作用。

OPG/RANK/RANKL 信号通路在参与骨代谢、免疫调节、肿瘤发生方面发挥重要调控作用，该通路可诱导破骨细胞分化成熟、促进骨吸收，而上调OPG 水平可降低RANKL 与RANK 的相互作用，降低骨吸收，促进成骨分化[18-19]。 激活OPG/RANKL/RANK信号通路可抑制破骨细胞的分化和成熟，促进BMSCs向成骨分化[20]。 本研究结果显示，经益肾健骨颗粒含药血清的大鼠BMSCs 细胞中OPG 表达水平显著升高（P<0.05），RANK、RANKL 表达水平显著降低（P<0.05），提示益肾健骨颗粒可调节OPG/RANK/RANKL信号通路。本研究结果也显示，与只经益肾健骨颗粒含药血清处理的BMSCs 细胞相比， 先转染抑制OPG 表达、 再用含药血清处理的BMSCs 细胞的OPG 表达水平显著降低，RANK、RANKL 表达水平显著升高，且ALP 活性及矿化结节数降低，即抑制OPG 表达可部分逆转益肾健骨颗粒对BMSCs 细胞成骨分化的促进作用。 以上结果表明，益肾健骨颗粒可通过调节OPG/RANK/RANKL 信号通路，促进绝经后骨质疏松大鼠BMSCs 成骨分化。

综上所述，益肾健骨颗粒可通过调节OPG/RANK/RANKL 信号通路，促进绝经后骨质疏松大鼠BMSCs 成骨分化。