五甲基槲皮素改善香烟烟雾提取物诱导的急性加重慢性阻塞性肺疾病

许夏燕，李 智，潘明月，韩雨彤，易刚强，袁劲松*

（1.汕头大学医学院，广东 汕头 515041；2.深圳市罗湖区人民医院，广东 深圳 518000；3.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；4.北京大学深圳医院，广东 深圳 518000）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease, COPD）是一种常见的可预防和可治疗的疾病，以持续的呼吸道症状和气流阻塞为特征，目前是全球常见的人类死亡原因之一，主要危险因素是香烟烟雾、病毒以及细菌。 目前，我国COPD 患者已经超过1 亿人，成为仅次于高血压、糖尿病的第三大常见慢性病[1-2]。 急性加重期慢性阻塞性肺病（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease, AECOPD） 是COPD 的呼吸道症状的急性恶化，是COPD 致死的重要因素。在COPD 患者中，46%的患者在前一年至少有一次病情加重，19%的患者需要住院治疗[3]。

AECOPD 的发病与气道炎症加重有关，吸烟和呼吸道感染是AECOPD 发生发展的主要危险因素[4]。香烟烟雾和其他有毒物质可触发肺组织中炎症细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 和IL-17A）的释放，从而招募炎症细胞，加重肺损伤[5]。 在治疗上，以减轻急性加重的病情以及预防再次急性加重的发生为目标，其中药物治疗是预防和控制AECOPD 的主要手段。 AECOPD 患者优先选用的药物为β2 受体激动剂、抗胆碱药，通过松弛支气管平滑肌，以达到扩张支气管、缓解气流受限、改善肺功能和低氧血症等目的[6]。 但是，长期使用糖皮质激素、抗生素、祛痰药物等，易产生耐药性。 所以，寻找新药用于AECOPD的治疗和预防具有重要的学术意义和临床价值。

五甲基槲皮素（pentamethylquercetin）是多甲氧基黄酮类家族的一员，由甲基取代槲皮素结构中的5 个酚羟基组成，具有良好的减轻胰岛素抵抗、抗炎、改善糖脂代谢紊乱的生物活性[7-9]，在药物稳定性、口服吸收率和生物利用度等多方面较槲皮素更具有优势[10-12]。 这些特性使五甲基槲皮素在预防和治疗AECOPD 中具有潜在的价值，其作用及相关机制未见报道。因此，本研究旨在探讨五甲基槲皮素对AECOPD 的疗效及作用机制。 本研究建立了香烟烟雾提取物诱导的AECOPD 细胞模型，明确了五甲基槲皮素对AECOPD 细胞模型的影响，并评估其涉及的炎性反应和凋亡的潜在分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

BEAS-2B 细胞株（中国科学院上海分院）；DMEM高糖培养基购自美国Gibco 公司；五甲基槲皮素购买自Puruifa 公司；细胞计数试剂8（cell counting kit-8, CCK8）购买自MCE 公司；β-actin、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K）、蛋白激酶B（proteinkinase B, AKT）、P38 蛋白激酶（P38 mitogen-activated protein kinase, P38）、应激活化蛋白激酶（c-Jun N-terminal kinase, JNK）、半胱氨酸蛋白酶3（Caspase 3）、活化后半胱氨酸蛋白酶3（cleaved Caspase 3）和B-细胞淋巴瘤因子2（B-cell lymphoma-2, BCL-2）一抗购买自美国Cell signaling Technology 公司；IL-6、IL-8 检测试剂盒购买自基因美公司。

1.2 主要仪器

双色红外荧光成像系统（型号：Odyssey，美国LICOR 公司）；荧光显微镜（型号：Axio Observer3 德国蔡司公司）；-80 ℃低温冰箱（型号：DW-HL828中科美菱公司）；多功能电泳系统（型号：1658033，美国伯乐）；微量移液器（型号：赛默飞F3 系列）、酶标仪（型号：FC）、二氧化碳培养箱（型号：BB150）均购自美国赛默飞公司。

1.3 香烟烟雾提取物（cigarette smoke extract, CSE）溶液的配制

香烟去掉滤嘴后点燃，采用50 mL 玻璃注射器收集香烟烟雾，香烟（每支含0.8 mg 尼古丁，10 mg 焦油）的烟雾导入20 mL 磷酸盐缓冲液中，经0.22 μm过滤器进行过滤，在320 nm 处测定吸光度，建立标准曲线，并以此标准曲线对滤出液浓度进行校准，所制得的CSE 溶液分装后冻存于-80 ℃冰箱备用。

1.4 细胞模型的建立及药物干预

将BEAS-2B 细胞培养于完全培养基中（含10%胎牛血清，1%青/链霉素双抗），静置于5% CO2、37 ℃的细胞孵箱中培养。 待细胞融合至约50%时，更换为不含血清的高糖培养基饥饿培养12 h，之后分为4 组：对照组、1%烟雾提取物组、2%烟雾提取物组、4%烟雾提取物组，采用含不同浓度CSE 溶液（0%、1%、2%、4%，v/v）的无血清培养基继续孵育BEAS-2B 细胞24 h，收集细胞上清液检测IL-6 和IL-8水平并确定后续实验CSE 建模浓度。 药物干预实验中，待细胞融合至约50%时即采用含不同浓度（0、1、3、10 μmol/L）五甲基槲皮素的无血清培养基预处理12 h，分为五甲基槲皮素1 μmol/L 组、五甲基槲皮素3 μmol/L 组、五甲基槲皮素10 μmol/L 组，各组分别采用含CSE 溶液的无血清培养基继续孵育细胞24 h，收集细胞上清液和蛋白用于后续实验。

1.5 细胞活力检测

将BEAS-2B 细胞（2×103）接种于96 孔板中，饥饿培养12 h 后采用含不同浓度CSE 溶液或PMQ的无血清培养基继续培养24 h。干预完成后每孔加入CCK8 试剂20 μL，继续培养2 h 后，计算细胞活力。 使用酶标仪检测细胞在570 nm 处的吸光度值，计算细胞活力。

1.6 IL-6、IL-8 水平检测

将细胞上清液（50 μL/孔）加入预铺抗体的96孔板中，按照试剂盒要求在室温下孵育2 h 后，加入检测抗体、链霉亲和辣根过氧化物酶（HRP）进行反应，弃去培养基，分别加入底物A、B 各50 μL，37 ℃避光孵育15 min 后，每孔加入终止液50 μL，15 min内在450 nm 波长处检测吸光度值。

1.7 PI3K、AKT、P38、JNK、BCL-2、Caspase 3、cleaved、Caspase 3 蛋白水平检测

取适量细胞蛋白样本进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳90 min 后将产物恒压转移至PVDF 膜，采用5%脱脂牛奶封闭液在室温条件下封闭1 h 后，加入目的蛋白抗体并在4 ℃冷室孵育过夜。 经TBST 溶液洗涤3 次后，加入荧光二抗在室温暗室条件下孵育1 h，采用奥德赛红外荧光扫描成像系统对条带进行荧光显影。 采用Image-Pro Plus 5.0 软件对各条带的灰度值进行分析。

1.8 统计学分析

采用GraphPad Prism 5.0 软件处理实验数据，计量资料以“±s”表示。 通过单因素方差分析和Newman-Keuls 检验对结果进行统计学分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞水平CSE 诱导AECOPD 模型的建立

与对照组相比，各浓度烟雾提取物组均可促进BEAS-2B 细胞IL-6 和IL-8 的释放（P<0.001），因此，本研究后续实验采用2%的CSE 溶液用于建立AECOPD 细胞模型。 详见图1。

图1 香烟烟雾提取物溶液对BEAS-2B 细胞IL-6 和IL-8 释放的影响

2.2 五甲基槲皮素可部分缓解CSE 诱导的AECOPD

0.1～10 μmol/L 五甲基槲皮素对细胞活力均无影响，后续实验采用1、3、10 μmol/L 这3 个浓度继续探索药物的效果和机制。与对照组相比，五甲基槲皮素1 μmol/L 组中IL-6 的水平降低（P<0.05）；五甲基槲皮素3 μmol/L 组和五甲基槲皮素10 μmol/L 组中IL-6 和IL-8 水平降低（P<0.01，P<0.05）；其中五甲基槲皮素10 μmol/L 组对细胞中IL-8 的抑制作用强于五甲基槲皮素1 μmol/L 组（P<0.05）；五甲基槲皮素各浓度组之间对IL-6 的抑制作用无统计学意义（P>0.05）。 详见图2。

图2 各组五甲基槲皮素对AECOPD 模型的影响

2.3 五甲基槲皮素可抑制CSE 诱导的细胞凋亡

与对照组相比，五甲基槲皮素1 μmol/L 组对Caspase 3、cleaved Caspase 3 表达影响无统计学意义（P>0.05），五甲基槲皮素3 μmol/L 组可抑制其蛋白表达（P<0.05），五甲基槲皮素10 μmol/L 组的抑制作用更为明显（P<0.01，P<0.001）；同时，五甲基槲皮素3 μmol/L 组上调BCL-2 的蛋白表达（P<0.01），五甲基槲皮素10 μmol/L 组上调BCL-2 的蛋白表达并且抑制JNK 水平（P<0.01，P<0.05）。 详见图3。

图3 各组五甲基槲皮素对AECOPD 模型中凋亡相关因子的影响

2.4 五甲基槲皮素可改善CSE 诱导的炎性反应

与对照组相比，五甲基槲皮素3 μmol/L 组PI3K和AKT 的表达水平降低（均为P<0.05）；五甲基槲皮素10 μmol/L 组对PI3K 和AKT 有较强的抑制作用（P<0.01），同时对P38 也有一定的抑制作用（P<0.05）。详见图4。

图4 各组五甲基槲皮素对AECOPD 模型中炎性因子的影响

3 讨论

气道炎症和黏液产生的急性加重，是导致COPD预后不良以及死亡的主要原因。 目前，COPD 的治疗药物主要以缓解症状为主，寻找新的疗法来预防疾病进展仍具有挑战性。 吸烟是COPD 和肺气肿等不可逆肺疾病的主要原因，研究表明，香烟烟雾的刺激改变了机体多种机制通路，如氧化应激、代谢改变、自主神经系统功能障碍和激素改变[3]。 IL-6 和IL-8在稳定和加重的COPD 的发病机制中发挥重要作用，且IL-6 已被视为常见的AECOPD 生物标志物[13]，AECOPD 患者中IL-6 和IL-8 水平显著高于健康对照组和稳定型COPD 患者[14-15]。在体外实验中，CSE经常被用作香烟烟雾的替代物，虽然体外暴露于CSE 可能不能准确反映体内暴露于香烟烟雾，但报道显示，当气道上皮细胞暴露于挥发性香烟烟雾时，更多的IL-8 被释放进入培养基中[16]。

本实验成功建立了AECOPD 的细胞模型，1%、2%、4%的CSE 溶液均可明显促进BEAS-2B 细胞IL-6 和IL-8 的释放。 为了更有效地观察药物效果，选取2% CSE 溶液干预细胞。 五甲基槲皮素是天然多甲氧基黄酮类家族（polyme thoxylated flavones,PMF）的一员，是将自然界中资源含量丰富的槲皮素的结构中5 个酚羟基以甲基取代。从药物稳定性、口服吸收率、生物利用度等多个方面与槲皮素进行比较，五甲基槲皮素更具有优势。 前期研究表明，五甲基槲皮素可下调炎性因子IL-6、TNF-α 的表达，改善炎症反应[17]。因此推测，五甲基槲皮素在CSE 诱导的AECOPD 细胞模型中也可能发挥其药效作用。在前期实验中，发现在CSE 溶液开始刺激细胞的同时给予五甲基槲皮素，细胞所释放的IL-6 和IL-8并没有发生变化，随后采取预防给药的方式继续探索五甲基槲皮素的作用。 在加入预防用药12 h 后，五甲基槲皮素可明显抑制细胞IL-6 和IL-8的释放，这一结果确定了在CSE 刺激下五甲基槲皮素对BEAS-2B 细胞的保护作用。

Caspase 3 和BCL-2 在细胞凋亡中扮演了重要的角色，本实验中发现，五甲基槲皮素可以抑制模型细胞中Caspase 3 的表达，同时增加BCL-2 的表达。此外，另有研究报道JNK 的激活可通过从BCL-2-Beclin1 复合物中释放Beclin1 来促进自噬[18-19]，本研究也发现了高剂量的五甲基槲皮素对JNK 也有一定的抑制作用。 这些结果说明，五甲基槲皮素有减轻BEAS-2B 细胞凋亡的潜在药理作用。

PI3K/AKT 信号通路可通过调控炎性介质释放等途径对气道炎性疾病产生影响，在COPD 的发生发展中扮演了重要的角色。如图4 所示，五甲基槲皮素可以剂量依赖性地抑制PI3K、AKT 表达。 另有文献报道，当气道上皮细胞暴露于挥发性香烟烟雾时，IL-8 也可通过P38 释放进入培养基中[16]，本实验研究发现高剂量的五甲基槲皮素也可抑制P38 的表达。 这些结果提示，五甲基槲皮素可从多种途径改善细胞的炎性反应。

综上所述，五甲基槲皮素可通过抑制PI3K/AKT、P38 信号通路，在CSE 诱导AECOPD 的模型中发挥抗炎作用；同时可抑制Caspase 3 并上调BCL-2，具有潜在的抗凋亡作用。 因此，五甲基槲皮素可以用于预防AECOPD 的发生和发展，具有潜在的药用价值。