烟叶中多菌灵胶体金定量试纸条的研制及应用

李晓芳，周润鑫，王春琼，魏力杰，张 燕，李天伟，王兆芹*

1. 北京勤邦生物技术有限公司，北京市昌平区回龙观国际信息产业基地高新四街8号 1022062. 北京市食品安全免疫快速检测工程技术研究中心，北京市昌平区回龙观国际信息产业基地高新四街8号 1022063. 云南省烟草质量监督检测站，昆明市高新技术产业开发区科医路41号 650106

多菌灵，化学名称为苯并咪唑-2-氨基甲酸酯，是一种广谱、高效、低毒、内吸性苯并咪唑类杀菌剂，广泛用于麦类、水稻、棉花、油菜、花生、甘薯、蔬菜、果树、花卉等植物的病害防治。市场上推广应用的苯并咪唑类杀菌剂产品主要有多菌灵、苯菌灵和甲基硫菌灵等。根据农业农村部农药登记资料，甲基硫菌灵为在烟叶上登记使用的农药，用于烟叶白粉病、根黑腐病的防治［1］。甲基硫菌灵、苯菌灵为不稳定化合物，在植物体内可代谢为多菌灵［2-4］。近年来，多菌灵在烟叶中检出率较高，给烟叶质量和生产带来一定的风险。目前，国内外对于多菌灵的分析方法主要有分光光度法［5-6］、超高效液相色谱法［7-8］、高效液相色谱法［9-10］、液相色谱-串联质谱法［11-13］、拉曼光谱法等［14-15］。上述方法需要在实验室环境下由专业人员进行操作，样品前处理繁琐费时，还需配备昂贵的仪器设备，检测成本高、耗时长、操作复杂。此外，也有报道利用酶联免疫法［16］、可视化微阵列蛋白芯片法［17］快速检测多菌灵的残留量，但样品集中在蜂蜜、蔬菜、水果等种类，同时这些方法对实验人员、环境、仪器设备也有严格要求，操作时间在1 h以上，不适用于基层现场快速检测。相关文献［1，18-22］中报道的烟叶中多菌灵检测方法主要是QuEchERS前处理技术与LC-MS/MS 检测技术相结合的方法，该方法操作复杂，成本高，不能完全满足我国烟叶质量控制需求。鉴于此，本研究中对胶体金试纸条产品形式进行筛选，在能满足检测需求的同时，利用变异系数较小的工艺制备试纸条产品；并配套手持式胶体金读数仪，绘制标准曲线，形成能现场定量检测烟叶样品的商品化试纸条产品。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

50个烟叶样品（2020年产自云南、贵州的中部和下部烟叶）。

1000 μg/mL的多菌灵乙醇溶液（农业农村部环境保护科研检测所）；苯菌灵、甲基硫菌灵、三唑酮、三唑醇标准品（≥99%，德国Dr. Ehrenstorfer 公司）；牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）、卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）、Triton X-100、羊抗鼠IgG（美国Sigam 公司）；碳酸钾、聚山梨酯-80、蔗糖、乙醇、甲醇（AR，国药集团化学试剂有限公司）；硝酸纤维素膜（NC膜，德国Sartorius公司）；胶体金溶液、多菌灵单克隆抗体、多菌灵半抗原-OVA 偶联物（自制）；样品稀释液为pH=7.2的0.02 mol/L磷酸盐缓冲液（自制）。

ESJ110-4A电子天平（感量0.0001 g，沈阳龙腾电子有限公司）；TGL16C台式高速冷冻离心机（湖南湘立科学仪器有限公司）；XYZ3060 三维喷点平台（美国Bio-Dot 公司）；CTS300 数控裁条机、ZQ2402微电脑自动斩切机（上海金标生物科技有限公司）；GT710 胶体金读数仪、KMH-102 恒温孵育器（北京勤邦生物技术有限公司）；FSJ-A05N6 磨粉机（小熊电器股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 多菌灵试纸条产品形式的确定

用胶体金免疫层析技术筛选出适合多菌灵试纸条的NC 膜、抗原抗体稀释液、金标垫和样品垫封闭液后，用冻干金配套试纸卡、喷金配套试纸卡两种工艺制备出试纸条。试纸卡分别以包被原和羊抗鼠IgG作为NC膜上的检测线（T线）和质控线（C线）［23］，采用划膜仪进行划线，两线相隔5 mm，喷量1 μL/cm，冻干金配套试纸卡、喷金配套试纸卡包被原的质量浓度分别为0.5、0.3 mg/mL，羊抗鼠IgG 的浓度分别为0.6、0.4 mg/mL，将包被好的NC膜置于37 ℃下干燥4 h；喷金配套试纸卡产品用喷膜仪将金标抗体按5 μL/cm的量均匀喷涂在金标垫上，37 ℃下干燥2 h；依次将NC 膜、金标垫、样品垫、吸水垫粘贴于PVC底板上，贴好后切成4 mm 宽的试纸条，装在特制的塑料制卡中并置于密封袋内，加干燥剂，密封，室温保存。基于冻干金配套试纸卡产品，向微孔板中加入50 μL多菌灵单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，冷阱温度-50 ℃条件下，预冻3 h，真空干燥15 h，即得到冻干有多菌灵单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂，密封4 ℃保存。试纸条制备完成后，往空白烟叶样品中添加不同质量分数（0、0.09、0.50 mg/kg）的多菌灵标准品，然后进行板内、批内变异系数测试，选择变异系数最小、同时能满足检测范围需求的产品形式。

1.2.2 多菌灵试纸条检测温度的确定

结合现场实验环境温度和抗原抗体耐受温度，选择室温（25 ℃）、30 ℃、33 ℃、35 ℃、40 ℃5 个温度，往空白烟叶样品中添加不同质量分数的多菌灵标准品，对比试纸条T、C 线比值（T/C 值）［23］的变化，选择T/C 值梯度较好的反应温度作为方法检测温度。

1.2.3 样品处理及检测方法

烟叶去主脉后在60 ℃条件下烘干，利用磨粉机将其粉碎，然后称取（1.00±0.05）g 样品，加入5 mL甲醇，振荡1 min。移取100 μL上清液，再加入900 μL样品稀释液，混匀即为待检液。将恒温孵育器提前加热至1.2.2 节确定的温度，将试纸条插入孵育器卡槽中，移取100 μL待检液，一次性垂直滴加于加样孔（S孔）中，反应10 min后，立即用胶体金读数仪读取结果。

1.2.4 标准曲线的绘制和定量范围的确定

按样品处理及检测方法测试多菌灵质量分数分别为0、0.020、0.045、0.090、0.15、0.25、0.50、1.0、1.5、2.0 mg/kg 的烟叶样品的T/C 值，每个质量分数的样品平行测试6次，计算平均值，结合仪器定值样品进行校正，根据校正后对应质量分数样品的T/C 值绘制标准曲线。对标准曲线线性较好的区间进行曲线拟合，R2大于0.99的线性范围为定量范围。

1.2.5 试纸条性能指标的确定

①特异性：分别向空白烟叶样品中添加其他常见的苯并咪唑类农药（苯菌灵、甲基硫菌灵、噻菌灵）及三唑酮、三唑醇至质量分数为10 mg/kg，用试纸条进行检测，每种药物平行测定2次，根据结果判定试纸条特异性。

②检测限：利用制备好的多菌灵试纸条检测20个经过预处理的阴性烟叶样品，用胶体金读数仪读取对应多菌灵的质量分数。计算20个阴性样品中多菌灵质量分数的平均值和标准差，参照文献［24］将多菌灵质量分数的平均值+3×标准差作为烟叶样品中多菌灵的最低检测限。

③准确性和精密度：取3个不同来源的空白烟叶样品，分别添加4 个质量分数水平（0.045、0.090、0.180、0.360 mg/kg）的多菌灵标准品，每个水平下用3批次的试纸条分别进行6次平行测试，根据各添加质量分数的实际测定值计算添加回收率和批内变异系数，从而判断试纸条的准确性和精密度。

④与高效液相色谱- 串联质谱法（High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）检测结果对比：随机选取50个烟叶样品，分别用多菌灵试纸条和仪器方法进行检测，确定阳性样品检出符合率。仪器检测方法参照YC/T 405.1—2011［18］的方法进行。

2 结果与讨论

2.1 多菌灵试纸条产品形式

由表1 可知，添加的多菌灵质量分数相同时，冻干金配套试纸卡的抑制率高于喷金配套试纸卡，表明冻干金配套试纸卡的灵敏度更高；但喷金配套试纸卡的板内和批内变异系数均小于冻干金配套试纸卡，同时喷金配套试纸卡无需溶解冻干金步骤。因此，选择喷金配套试纸卡作为多菌灵试纸条的产品形式。

表1 多菌灵试纸条的产品形式Tab.1 Product types of test strips for carbendazim

2.2 多菌灵试纸条检测温度

利用胶体金读数仪，检测出7个梯度样品中多菌灵的质量分数。由图1可知，温度一定时，随着多菌灵质量分数的增加，T/C 值呈下降趋势，原因是多菌灵检测试纸条应用了竞争抑制免疫层析的原理，样品中的多菌灵在流动过程中与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，抑制了抗体和NC膜检测线（T线）上的多菌灵-BSA偶联物的结合，从而导致检测线颜色发生变化。对于多菌灵质量分数相同的样品，T/C值随温度升高而增大，其中，40 ℃时，空白样品与多菌灵质量分数为2.000 mg/kg的样品的梯度最大，线性范围最好，更有利于后续标准曲线的绘制。因此，最终选择40 ℃为多菌灵试纸条的检测温度。

图1 不同检测温度和多菌灵质量分数下试纸条T/C值的变化Fig.1 Variations of T/C value of test strip at different detection temperatures and carbendazim mass fractions

2.3 标准曲线和定量范围

当空白烟叶样品中添加多菌灵质量分数分别为0、0.020、0.045、0.090、0.15、0.25、0.50、1.0、1.5、2.0 mg/kg的多菌灵标准品时，对比利用多菌灵试纸条测试的T/C 值结果与仪器定值样品结果，确定最终10个质量分数水平的样品的T/C 值，然后以多菌灵的质量分数为横轴，T/C值为纵轴，绘制标准曲线，如图2 所示。取曲线中线性范围较好区间（0.020～0.50 mg/kg）进行曲线拟合，如图3 所示，回归方程为y=0.721lnx+0.273，R2=0.999。因此，确定该方法的定量范围为0.020～0.50 mg/kg。

图2 胶体金试纸条的标准曲线Fig.2 Standard curve of colloidal gold test strip

图3 多菌灵质量分数为0.020～0.50 mg·kg-1范围内的拟合标准曲线Fig.3 Fitting standard curve of carbendazim in the mass fraction range of 0.020-0.50 mg·kg-1

2.4 多菌灵试纸条性能指标

2.4.1 特异性

由表2可知，利用多菌灵试纸条检测与多菌灵具有类似功能或结构的农药时，如苯菌灵、甲基硫菌灵等，检测结果均为阴性，表明该试纸条与其他苯并咪唑类杀菌剂和三唑类药物无交叉反应，具有较好的特异性。

表2 多菌灵试纸条的特异性结果Tab.2 Specific results of test strip for carbendazim

2.4.2 检测限

利用制备好的多菌灵试纸条测定20个阴性烟叶样品，检测结果见表3。20个阴性样品对应的多菌灵质量分数的平均值为0.005 mg/kg，标准差为0.004 mg/kg。根据1.2.5 节中最低检测限的定义可知，对于本研究中制备的试纸条，烟叶样品中多菌灵的最低检测限为0.017 mg/kg。

表3 阴性样品中多菌灵质量分数的测定结果Tab.3 Mass fractions of carbendazim in negative samples

2.4.3 准确性和精密度

向空白烟叶样品中添加多菌灵标准品至质量分数为0.045、0.090、0.180、0.360 mg/kg 4个水平，每个质量分数对应的样品用3 批次的试纸条分别进行6次平行测试，结果见表4。可见，多菌灵试纸条定量检测方法的加标回收率范围为95.6%～128.9%，批内变异系数范围为6.2%～11.2%，均符合检测方法要求。

表4 多菌灵试纸条检测的准确性和精密度结果（n=6）Tab.4 Accuracy and precision of test strip for carbendazim（n=6）

2.4.4 与仪器方法检测结果对比

检测的50 个烟叶样品中，仪器检测结果为阴性的样品有30个。其中，对应的试纸条检测结果中有29 个均小于试纸条检测限，也为阴性；仅46号样品的检测结果（0.032 mg/kg）大于检测限，说明试纸条检测有一定的假阳性，阴性样品检测结果准确率大于95%。在烟叶生产加工过程中，需要用不同原料混合配料；同时在检测过程中，需要对待检样品进行抽样、去主脉粉碎后检测，样品的取样代表性和均一性对检测结果影响较大。因此，为了降低假阴性，快速检测方法允许有一定的假阳性。

20 个阳性样品的试纸条检测结果和仪器检测结果如表5 所示，相对偏差在3.00%～48.59%之间，对两种检测结果的相关性分析如图4所示。试纸条检测结果与HPLC-MS/MS 检测结果的线性方程为y=0.8351x+0.0460，相关系数R=0.8456；在定量范围0.020～0.50 mg/kg 内的线性方程为y=0.9128x+0.0068，相关系数R=0.9604。结果表明，多菌灵试纸条的检测结果与HPLC-MS/MS 检测结果在定量范围内线性关系良好，可以应用于烟叶中多菌灵的检测筛选工作。

表5 试纸条与HPLC-MS/MS检测实际烟叶样品中多菌灵质量分数的结果①Tab.5 Test results of mass fractions of carbendazim in tobacco leaves by test strip and HPLC-MS/MS（mg·kg-1）

图4 试纸条与HPLC-MS/MS法检测烟叶中多菌灵的相关性结果Fig.4 Correlation between test results of test strip and HPLC-MS/MS for carbendazim in tobacco

在实际检测工作中，取样代表性、样品粉碎程度和含水率等会影响检测结果，为了更好地提高烟叶中多菌灵的检测结果准确率，建议从生产、流通环节加强质量监管，将合格品和不合格品进行分类管理。

3 结论

用胶体金免疫层析技术并配套胶体金读数仪，建立了能有效检测烟叶中残留的多菌灵药物的快速定量检测方法。①研制的多菌灵定量试纸条的检测限为0.017 mg/kg，检测范围为0.020～2.0 mg/kg，定量范围为0.020～0.50 mg/kg，加标回收率为95.6%～128.9%，批内变异系数为6.2%～11.2%；与HPLC-MS/MS 检测结果相比，阴性样品检测结果准确率大于95%，阳性样品检测结果在定量范围0.020～0.50 mg/kg内线性关系良好。②对于与多菌灵结构相似的药物，试纸条与其无交叉反应，可特异性地定量检测烟叶中多菌灵残留的质量分数。