贝莱斯芽胞杆菌F10 促生作用及对烟草青枯病的防治效果

周向平，滕 凯，肖启明，陈 武，王凯歌，张洪波，刘 峰，刘天波*，4

1. 湖南农业大学植物保护学院，长沙市芙蓉区农大路1号 4101282. 湖南省烟草公司永州市公司，湖南省永州市冷水滩区珍珠北路69号 4250003. 湖南省烟草公司湘西自治州公司，湖南省吉首市人民南路118号 4160004. 湖南省烟草科学研究所，长沙市芙蓉南路一段628号 410004

由茄青枯假单胞菌（Ralstonia solanacearum）引起的烟草青枯病是烟叶生产上的重要病害之一，对烟叶生产可造成毁灭性的危害。近年来烟草青枯病危害程度呈明显上升趋势，严重威胁着我国的烟草生产［1］。目前防治烟草青枯病主要采用化学农药，但长期使用化学农药容易使病原菌产生抗药性，并造成环境污染［2］。生物防治是一种具有良好发展前景的防治手段，目前利用有益微生物防控青枯病已成为国内外研究的热点［3］。

植物根际促生菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）是土壤中直接或间接有益于植物生长的微生物［4］，对病原菌具有拮抗作用［5］，可诱导植物系统抗性（Induce systemicresistance，ISR）［6］，已成为生物防治的重要资源。在水稻、小麦和番茄等粮食作物和蔬菜上的PGPR研究与应用较多，并已发 现 假 单 胞 菌 属（Pseudomonas）［7］、链 霉 菌（Streptomyces）［8］和芽胞杆菌属（Bacillus）［9］等多个种属的土壤微生物具有促生潜能。贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）作为芽胞杆菌的一个新种备受关注，该菌具有广谱抑菌活性，被广泛应用于植物病害的生物防治［10］。沙月霞等［11］研究发现，贝莱斯芽胞杆菌E69 预防稻瘟病等多种真菌病害，对叶瘟和穗颈瘟的田间预防效果分别达到85.97%和69.67%；余水等［12］试验发现，贝莱斯芽胞杆菌MT310 对烟草赤星病菌（Alternaria alternata）抑制率为68.76%。贝莱斯芽胞杆菌能促进马铃薯［13］、辣椒［14］和黄瓜［15］等的生长，有效抑制青枯病菌（Ralstonia solanacearum）、赤星病菌（Alternaria Alternate）和烟草黑胫病菌（Phytophthora nicotianae）等病原菌的生长［16］。李苗苗等［17］研究表明，贝莱斯芽胞杆菌GY1 可显著促进烟草种子的萌发和烟株的生长，GY1 菌悬液处理烟草种子，萌发率较对照提高20.67%；闫助冰等［18］筛选出具有较强拮抗作用的贝莱斯芽胞杆菌XC1，能显著促进平邑甜茶幼苗的生长；耿妍等［19］灌根施用贝莱斯芽胞杆菌B006 菌剂处理的盆栽茄子株高、茎粗、根长和根干质量比对照分别提高16.7%、20.7%、28.7%和67.0%。贝莱斯芽胞杆菌因其具有抑制病原菌、提高宿主免疫力、促进植物生长等功能，已广泛应用于农作物病害的防控，如贝莱斯芽胞杆菌FZB42已经被商业化应用，作为生物肥料和生物防治剂在农业领域被广泛使用［20］。近年来，国内外有关贝莱斯芽胞杆菌的报道越来越多，但对贝莱斯芽胞杆菌作为植物根际促生菌在烟草上的促生和抗病等方面研究仍鲜见报道。为此，以前期试验获得的植物根际促生菌贝莱斯芽胞杆菌F10为材料，通过盆栽和田间小区试验考察其对烟草的促生作用和对烟草青枯病的防治效果，旨在为生防菌的田间应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌种贝莱斯芽胞杆菌F10（保藏号：CBMB205）为前期试验筛选，对茄青枯假单胞菌（Ralstonia solanacearum）具有较强的拮抗作用。烟草青枯病菌由本实验室分离保存。

供试烟草品种为云烟87，在育苗基质中培育至5～6 片真叶，备用。培养基为NA 培养基（生防菌F10培养）和LB培养基（烟草青枯病菌培养）。

盆栽试验土壤取自湖南省宁乡市喻家坳乡三民村附近农田，土壤类型为水稻土，有机质38.24 g/kg，全氮2.12 g/kg，碱解氮165.48 mg/kg，速效钾204.13 mg/kg。

1.2 方法

1.2.1 烟草根系性状指标测定

盆栽试验在湖南省宁乡市喻家坳乡三民村烟草育苗基地温室中进行。设置3 个处理，处理1：生防菌F10；处理2：25%溴菌·壬菌铜（Bromothalonil azelaic bacteria copper，BABC）；处理3：对照（CK）。每处理3 次重复，每重复植烟20 株。选择长势一致的5～6 片真叶期的烟苗，移栽于装有灭菌土的花盆中，移栽后立即于根际灌根接种活化后的生防菌F10（浓度1×108CFU/mL）菌液和BABC（稀释1000倍），每株约50 mL，对照接入等量的NA培养基。

在移栽后10、20和30 d各处理随机取3株烟苗，将烟苗整株挖出，用清水冲洗干净，测量根鲜质量、总根长、总根表面积和总根体积，采用TTC法［21］测定根系活力。将根系放置于烘箱中于105 ℃杀青30 min，60 ℃继续烘干48 h，取出测定根系干质量。

1.2.2 烟草地上部分农艺性状指标测定

在移栽后10、20和30 d各处理随机取3株烟苗，自然条件下风干后，参照文献［22-23］的方法测量整株鲜质量、株高、茎围、叶数和最大叶面积等农艺性状指标。将烟株置于烘箱中105 ℃杀青30 min，60 ℃继续烘干48 h，取出测定整株干质量。

1.2.3 烟草叶片生理指标测定

移栽后10、20和30 d各处理随机取3株烟，每处理取烟株中部3 片叶，剪碎混合均匀后，参照文献［24］测定过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用过氧化氢分解量法测定过氧化氢酶（CAT）活性［25］。重复测定3次，取平均值。

1.2.4 生防菌对烟草青枯病的防治效果评价

通过盆栽和田间小区试验评价生防菌对烟草青枯病的防治效果。试验设计同1.2.1 节。处理24 h后，将烟草青枯菌悬液（1×108CFU/mL）接种于各处理的烟苗根际，每株5 mL。盆栽试验将烟株置于30 ℃的温室中保温保湿培养，大田小区试验接种后自然生长，并观察发病情况。始见病株后，第14 天调查病害发生情况。依据GB/T 23222—2008［26］进行病害调查，并统计发病率、病情指数和防治效果。

计算公式：

田间小区试验在湖南省江永县夏层铺镇东铺村旱地烟田进行，选取连年青枯病发病较重的烟田地块。试验设计同盆栽试验，每小区面积67 m2（约100 株），随机排列，小区之间设置隔离行，小区边缘设置保护行。移栽时和移栽后30 d 分别用生防菌F10 发酵液（1×108CFU/mL）和BABC（稀释1000 倍液）灌根，每株200 mL，对照用等量NA 培养基灌根。按优质烟叶生产技术规程进行田间管理。在烟草青枯病始发期开始调查，每7 d调查1次病害发生情况，共调查3次。调查统计方法同盆栽试验。

1.2.5 大田烟株农艺性状和经济性状指标测定

田间小区试验评价生防菌对烟株农艺性状和经济性状的影响处理设置同1.2.2 节。团棵期（移栽后40 d）、旺长期（移栽后60 d）和成熟期（移栽后80 d）在各小区选取代表性的未发病烟株10 株，参照YC/T 142—2010［27］调查并记载烟株株高、茎围、叶数和最大叶面积。烟叶成熟后，分小区采收、编竿，用密集式烤房、三段五步式烘烤工艺进行烘烤，按照烤烟分级标准GB2635—1992［28］进行烟叶分级，并统计烟叶产量、上等烟比例和上中等烟比例。

1.2.6 数据处理

使用Excel 2010 软件进行数据统计，使用SPSS 18.0软件进行方差分析，用最小显著差数法（LSD）进行数据间差异的显著性检验。

2 结果与分析

2.1 生防菌对烟株根系发育的影响

图1 结果表明，生防菌对烟株生长发育影响明显。处理后30 d，F10处理烟株的根系发育显著优于BABC处理和CK。

图1 不同处理对烟株根系生长的影响（移栽后30 d）Fig.1 Effects of different treatments on root growth of tobacco plants（30 days after transplanting）

从根系鲜质量（图2a）来看，不同时期F10 处理根系鲜质量均显著高于BABC 处理和CK，移栽后30 d F10处理根系鲜质量比CK提高58.72%；从根系干质量来看（图2b），移栽后20 d和30 d F10处理根系干质量显著高于BABC处理和CK，在移栽后30 d，F10 处理根系干质量比CK 增加58.55%；从总根长（图2c）来看，移栽后10、20 和30 d F10 处理总根长比BABC处理和CK显著增长，移栽后30 d F10处理总根长比CK 增加15.46%；从总根表面积（图2d）和总根体积（图2e）来看，在不同时期F10 处理总根表面积和总根体积均显著高于BABC处理和CK；从根系活力来看（图2f），在不同时期F10处理根系活力均显著大于其他处理，移栽后30 d F10 处理根系活力比CK提高35.65%。

图2 不同处理对烟株根系发育的影响Fig.2 Effects of different treatments on root development of tobacco plants

2.2 生防菌对烟株地上部分生长的影响

图3 结果表明，生防菌对烟株地上部生长影响明显。处理后30 d，生防菌F10处理烟株的长势显著优于BABC 处理和对照，其中对烟株株高和叶面积影响最为明显。

图3 不同处理对烟株生长的影响（移栽后30 d）Fig.3 Effects of different treatments on growth of tobacco plants（30 days after transplanting）

不同处理烟株农艺性状指标测定结果见图4。从图4a和图4b来看，移栽后10、20和30 d，F10处理烟株鲜质量和干质量均显著高于BABC处理和CK，移栽后30 d F10 处理烟株鲜质量和干质量分别比CK 提高34.38%和38.93%。从株高来看（图4c），在不同生长时期F10 处理烟株显著高于BABC 处理和CK，移栽后30 d F10处理烟株比CK提高54.30%；从茎围来看（图4d），不同时期F10 处理烟株均显著高于BABC 处理和CK，随着生育期的推进，差异逐渐增大，移栽后30 d F10处理烟株较CK提高51.20%；从叶数来看（图4e），不同时期F10 处理的烟株叶数均显著高于BABC处理和CK，移栽后30 d F10处理叶数较CK提高23.07%。从最大叶面积来看（图4f），在不同时期F10 处理烟株最大叶面积均显著大于BABC 处理和CK，移栽后30 d F10 处理烟株最大叶面积比CK提高43.12%。

图4 不同处理对烟株农艺性状的影响Fig.4 Effects of different treatments on agronomic traits of tobacco plants

2.3 生防菌对烟草叶片生理指标的影响

施用生防菌F10 可明显提高烟草叶片POD、SOD和CAT 3种酶的活性（图5）。从POD活性来看（图5a），3 个处理的烟草叶片POD 活性均呈增加趋势，F10处理和BABC与CK之间存在显著差异，F10处理烟草叶片POD活性最高，移栽后30 d，F10处理的烟草叶片POD活性比对照提高25.32%；从SOD活性来看（图5b），F10 和BABC 处理烟草叶片酶活性均高于CK，不同时期F10处理的烟草叶片SOD活性均最高；从CAT活性来看（图5c），F10处理对烟草叶片CAT活性的影响在移栽后10、20和30 d呈现先下降后上升的趋势，但烟草叶片CAT 酶活性均显著高于CK。

图5 不同处理对烟草叶片生理指标的影响Fig.5 Effects of different treatments on physiological indexes of tobacco leaves

2.4 生防菌对烟草青枯病的防治效果

温室盆栽和小区试验（表1）结果表明，生防菌F10 对烟草青枯病有明显防治效果，温室盆栽和田间试验中，生防菌F10 对烟草青枯病防效分别为60.49%和54.91%，防效显著高于化学药剂BABC。

表1 不同处理对烟草青枯病的防治效果①②Tab.1 Control effects of different treatments against tobacco bacterial wilt

2.5 生防菌对大田烟株农艺性状和经济性状的影响

2.5.1 生防菌对大田烟株农艺性状的影响

不同生长时期，不同处理烟株的农艺性状指标差异显著（表2）。施用生防菌F10 可显著改善烤烟的农艺性状，烤烟株高、茎围、叶片数和最大叶面积均高于BABC 处理和CK。团棵期生防菌F10 处理较CK 株高、茎围、叶片数和最大叶面积分别提高11.02%、3.80%、1.02%和3.73%；旺长期生防菌F10处理较CK 株高、茎围、叶片数和最大叶面积分别提高2.18%、0.37%、5.16%和3.30%；成熟期生防菌F10 处理较CK 株高、茎围、叶片数和最大叶面积分别提高3.51%、3.76%、5.42%和4.51%。

表2 不同时期各处理烟株农艺性状比较Tab.2 Agronomic traits of tobacco plants at different stages under different treatments

2.5.2 生防菌对烟叶经济性状的影响

施用生防菌F10 能显著提高烤烟经济性状指标，烟叶产量、上等烟比例和上中等烟比例均高于BABC 处理，显著高于CK（表3）。与CK 相比，烟叶产量、上等烟比例和上中等烟比例分别提高11.82%、31.46%和13.17%。表明施用生防菌F10有助于提高烤烟经济效益。

表3 不同处理烟叶经济性状比较Tab.3 Economic traits of tobacco leaves under different treatments

3 讨论

贝莱斯芽胞杆菌是芽胞杆菌属的一个新种，具有广谱抑菌活性和促生长作用，被广泛应用于植物病害的生物防治［29］。本研究中发现根际接种贝莱斯芽胞杆菌F10 能促进烟草根系生长发育，烟株根系鲜质量、干质量和根系活力等指标显著提高，同时可促进烟草地上部的生长发育，对烟株茎围、株高和叶面积的影响尤为明显，这与李苗苗等［17］的研究结果一致。贝莱斯芽胞杆菌F10 能促进烟株和根系生长，从而更高效地促进烟苗对水分和养分的吸收，进而增强了叶片光合作用，推断可能与其能够释放促进植物生长的植物激素和挥发性化合物有关［30］。本研究中仅对烟株及根系的生长发育进行了测定，而有关生防菌促生的相关物质及作用机制还有待进一步研究。

诱导植物抗性是植物根际促生菌生防作用的重要机制之一，可以通过JA/ET 信号通路诱导植物ISR，通过活性氧爆发、细胞壁的强化、防御相关酶的累积以及抗菌物质的产生等诱导植物细胞的防御反应［31］。活性氧具有双重作用，在激发寄主抗病反应的同时，活性氧的积累超过一定量时也会使寄主本身细胞受到伤害［32］，植物可通过SOD、POD 和CAT等抗氧化酶来清除活性氧的危害［33］。本研究中发现烟草根际接种生防菌F10后，叶片SOD、POD和CAT等几种防御酶活性均显著提高，表明生防细菌F10可诱导烟草产生系统抗性，可能与增强烟株对青枯病的抵抗力有关，与陈冉等［34］在拟南芥上和陈爽等［35］在大豆上的研究结果基本一致。贝莱斯芽胞杆菌能产生多种次级代谢产物，但这些抑菌物质激发宿主的主要免疫应答机制尚不清楚，且本研究中测定的防御酶也存在局限性，下一步将扩大防御酶测定范围，定向研究某一种或某一类抑菌物质对宿主的生防作用，利用代谢组学分析贝莱斯芽胞杆菌与宿主相互作用时的应答机制。

本研究结果表明，烟草根际接种贝莱斯芽胞杆菌F10 显著降低了烟草青枯病发病率和病情指数，温室盆栽和大田小区试验相对防效优于化学药剂溴菌·壬菌铜，与刘艳霞［36］的研究结果一致。植物根际促生菌不仅能抑制烟草病害，还能促进烟株大田生长，有效改善烤烟的农艺性状，提高烤后烟叶等级结构，提高经济效益［37］，但对烟叶外观品质和内在品质的影响还有待进一步研究。

4 结论

贝莱斯芽胞杆菌F10 对烟草具有促生和防病作用，可明显改善烟草根系和地上部农艺性状，提高烟草叶片POD、SOD 和CAT 等抗氧化酶的活性，对烟草青枯病防治效果达到50%以上，烟叶产量、上等烟和上中等烟比例均有提高，烤烟经济效益也显著提高。