生物制备全烟草组分再造烟叶及结构特性分析

丁一郎，叶建斌，杨金初，胡仙妹，尹献忠，李 鹏，李浩亮，张 展*，杨雪鹏*

1. 郑州轻工业大学食品与生物工程学院，郑州高新技术产业开发区科学大道136号 4500012. 莆田学院，福建省莆田市城厢区学园中街1133号 3511003. 河南中烟工业有限责任公司技术中心，郑州市管城区陇海东路72号 4500004. 中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2号 450001

加热卷烟是一种依赖加热设备为辅助抽吸工具的新型烟草制品，其在低温下（一般不超过400 ℃）加热使用，可以避免烟草特有亚硝胺、焦油以及潜在有害成分等的生成［1］。在满足吸食者体验感和满足感［2］的同时，有效提高了烟草制品的安全性。加热卷烟的原料包括再造烟叶、烟丝及烟草颗粒等［3］。其中再造烟叶因具有成本低、有害物质少、成分调控灵活等优点，成为目前市售加热卷烟的主要原料［4］。用于加热卷烟的再造烟叶的生产工艺主要有造纸法、辊压法、稠浆法3种。目前，绝大多数再造烟叶配方中需要添加木浆纤维、黏合剂、香精香料等，用以提高物料的黏结性、改善片基强度、丰富再造烟叶香气，从而保障加热卷烟的品质［5］。然而，外加纤维或黏合剂等导致的木质杂气、苦味会使烟气粗糙，香吃味变差，且部分香精香料与烟草本香还存在一定程度的不协调。因此，寻找一种与加热卷烟基材相适配、能有效负载香气的纤维材料，有望减少或取代木浆纤维、黏合剂的使用，同时还可以改善加热卷烟原料的烟草本香。

细菌纤维素（Bacteria cellulose，BC）是一类由细菌胞外合成的多糖［6］，与植物纤维素相比，具有纯度高、持水性好、机械拉伸性能强［7］等特点。同时纳米级纤维结构展现了良好的生物相容性［8］，被广泛应用于食品、纺织、医疗等领域［9］。张婷婷等［10］报道了利用废弃烟叶为底物发酵合成细菌纤维素，有利于将浸提液中的烟碱及香味物质均匀吸附到细菌纤维素的细微网格结构中，较好保留了烟草原味物质，赋予细菌纤维素丰富的烟草特点。同时，这种利用生物技术的方法处理烟草废弃物得到的细菌纤维素可有效降低生产成本［11］。据此，以烟草废弃物为原料，首先利用生物发酵得到负载天然烟草成分的细菌纤维素，然后通过重新组合发酵剩余的浸提液、原料以及合成的细菌纤维素，结合辊压法和稠浆法的生产工艺，制成一种物理结构良好、香气成分充足、加工性能优良的再造烟叶，旨在减少或不加入木浆纤维、黏合剂等外加添加剂，为开发高性能加热卷烟用新型再造烟叶提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

废弃烟末（由河南中烟工业有限责任公司黄金叶制造中心提供）；木醋杆菌Acetobacter xylinusYB（由郑州轻工业大学自主筛选保藏）；造纸法再造烟叶（SH-01）、稠浆法再造烟叶（SH-02）、造纸法再造烟叶（SH-03），3种再造烟叶来源于市售加热卷烟（配方中使用木浆纤维、烟用香精香料等）；BC重组再造烟叶（CZ-01）（自制）。

无水葡萄糖（AR，天津市大茂化学试剂厂）；酵母浸粉（AR，北京奥博星生物技术有限公司）；制霉菌素（AR，阿拉丁试剂有限公司）；丙三醇（AR，天津富宇精细化工有限公司）。

CDS 5250-T/7890B-5977A型热裂解-气相色谱/质谱联用仪（北京莱伯泰科仪器股份有限公司、美国Agilent公司）；JSM-7001F型场发射扫描电子显微镜（日本电子株式会社）；STA449F3 型同步热分析仪（德国耐驰仪器公司）；Vertex 70 型傅里叶变换红外光谱仪（美国Bruter 公司）；BSA2202S 型电子天平（感量0.0001 g，北京赛多利斯仪器有限公司）；BHZ-1 型薄片厚度计（四川长江造纸仪器有限责任公司）；ZKW-3 型烟草薄片抗张试验机（四川长江造纸仪器有限责任公司）；DGG-9140 型电热恒温鼓风干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）；AA3 型连续流动分析仪（德国布朗卢比公司）；7890B 型气相色谱仪（美国Agilent公司）。

1.2 方法

1.2.1 细菌纤维素制备

种子培养基制备：无水葡萄糖70 g、酵母浸粉10 g，用1 L去离子水定容后115 ℃灭菌20 min。

烟草浸提液制备：废弃烟末400 g、去离子水5 L，60 ℃浸提1.5 h，过滤后121 ℃灭菌20 min。

细菌纤维素培养：接种量6%、培养12 h 后分装培养盒继续培养7 d左右，收获细菌纤维素。

1.2.2 重组再造烟叶制备

原料处理：将上述用于制备烟草浸提液的废弃烟末过滤后烘干，同其他未利用的废弃烟末研磨成粉，细菌纤维素打碎成浆状。按质量比1∶5添加烟粉和细菌纤维素浆，添加占烟粉质量20%的甘油，混合均匀。

再造烟叶成型：浆料均匀铺在衬布和纸带间辊压，辊间距为（1.2±0.1）mm，成型后裁切成长（14.0± 0.5）cm 和宽（12.0 ± 0.5）cm 的矩形薄片，放置60 ℃烘箱内干燥30～60 min 至含水率为15%～18%，获得BC重组再造烟叶。

工艺流程如图1所示。

图1 BC重组再造烟叶生产加工流程图Fig.1 Flow chart of manufacturing of BC reconstituted tobacco

1.2.3 红外光谱分析

先将4种再造烟叶研磨成粉，再与光谱级溴化钾粉末以m（烟粉）∶m（溴化钾粉末）=1∶100的质量比在玛瑙钵中混合研磨，用压片机以10 MPa 压力压片，用红外光谱仪进行结构表征，扫描范围为400～4000 cm-1，扫描次数64次。

1.2.4 场发射扫描电镜观察

将冷冻干燥处理后的4 个样品用导电胶粘在铜座上，喷金处理120 s，将镀金后的样品放入仪器真空系统中，加速电压5 kV，调整放大倍数和拍摄区域，在200～20000倍之间观察各样品形貌，选取清晰的纤维图片进行样品微观结构分析。

1.2.5 物理性能测定

按照国标和行业标准［12-14］中的方法对再造烟叶的厚度、定量、松厚度、抗张强度进行测定和计算，对比物理指标差异。

1.2.6 热性能分析

样品分析前，设置同步热分析仪在800 ℃下保持10 min，排净炉体杂质，分别称取（10.0±0.1）mg样品置于热重坩埚内进行测试，氮气气氛下，升温程序为初始温度30 ℃，升温速率10 ℃/min，升至800 ℃，保持10 min；空气流量50 mL/min。

1.2.7 化学成分分析

化学成分测定：将4 种再造烟叶放置于温度（22±1）℃、相对湿度60%±2%的环境中平衡48 h，按照行业标准［15-16］中的方法测定再造烟叶中的烟碱和水溶性总糖含量。

热裂解条件：初始温度80 ℃，以100 ℃/min升至120 ℃并保持2 min；然后以20 ℃/s 升至300 ℃并保持30 s。

气相色谱条件：毛细管色谱柱DB-5 MS（50 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气为高纯氦气；进样口温度280 ℃；分流比为50∶1；色谱柱流量1.0 mL/min；升温程序为初始温度40 ℃，以10 ℃/min升至250 ℃，再以10 ℃/min升至280 ℃，保持5 min。质谱条件：电子轰击（EI）电离源；电子能量70 eV；传输线温度300 ℃；离子源温度230 ℃；溶剂延迟2 min；质量扫描范围：33～450 amu；扫描方式：全扫描。图谱库：NIST11。

2 结果与讨论

2.1 BC重组再造烟叶形貌分析

制备的BC重组再造烟叶样品如图2所示，观察可见其均质化程度较高，孔隙少。比较再造烟叶正反两面差异，背面色泽略深，质地较光滑；正面颜色较浅，质地较粗糙。与以往再造烟叶中添加的木浆纤维不同，BC重组再造烟叶采用具有黏性的纳米级超细纤维，能够取代黏合剂和外加木浆纤维，促进再造烟叶成型，说明该工艺可行性良好。

图2 BC重组再造烟叶正反面外观（3024×4032 像素）Fig.2 Front and back appearances of BC reconstituted tobacco

2.2 物理性能测定

4种样品的厚度、定量、松厚度、抗张强度测量结果如表1所示。通过对比可以看出，4种再造烟叶物理性能指标存在一定差异。造纸法再造烟叶（SH-01、SH-03）的纤维排列疏松，存在较多孔隙，因此其定量和抗张强度值较小、松厚度值较大；稠浆法再造烟叶（SH-02）的纤维直径较小且结构致密，故具有较高的定量和抗张强度、较小的松厚度；BC 重组再造烟叶（CZ-01）的纤维细长、密度大，交织缠绕使得结构更加致密，有利于通过增加其定量和抗张强度展现更佳的机械性能［17］。此外，BC重组再造烟叶（CZ-01）与稠浆法再造烟叶（SH-02）的物理指标相接近，其原因可能是两者具有相似的配方和结构。

表1 4种再造烟叶的物理指标测量结果Tab.1 Physical indicators of four reconstituted tobacco samples

2.3 红外光谱分析

4种再造烟叶的红外光谱对比见图3。由图3可知，BC 重组再造烟叶和3 种市售加热卷烟再造烟叶的红外吸收情况基本相同。波数3434 cm-1处的峰形较宽，归属于纤维素分子间和分子内氢键引起的O-H伸缩振动；波数2925 cm-1处的吸收峰归属于亚甲基C-H的伸缩振动；波数1620 cm-1处为纤维素4’端半缩醛基吸收峰［18］；波数1335 cm-1和1415 cm-1处发生纤维素和半纤维素-CH3的对称弯曲振动和-CH2的剪式弯曲振动；1105 cm-1处的吸收峰归属于C-C骨架振动；波数1045 cm-1处是C-O单键的振动吸收峰，推测是雾化剂中具有伯醇结构的醇类物质［19］；918 cm-1处是β-D 糖苷键面内弯曲振动吸收峰。BC重组再造烟叶与3种样品的官能团特征吸收峰相同，具有相似的化学官能团，说明BC 重组再造烟叶没有引入特殊的化学杂质。

图3 4种再造烟叶的红外光谱图Fig.3 Infrared spectra of four reconstituted tobacco samples

2.4 场发射扫描电镜观察

4 种再造烟叶的微观电镜图见图4。由图4 可知，SH-01再造烟叶表面较平整，纤维呈扁平状、无序结构排列。SH-02再造烟叶的纤维表面被细微的烟粉颗粒包裹、较光滑，周围存在明显的孔隙。SH-03再造烟叶可以观察到较多的杆状纤维，层状堆叠、结构松散且上面附着有较大的烟粉团粒。CZ-01 重组再造烟叶的质地较为均匀，在相同放大倍数下其组织结构较其他再造烟叶更加致密紧实。

图4 200倍下4种再造烟叶表面形貌图Fig.4 Surface morphology of four reconstituted tobacco samples（×200 times）

为进一步比较各种再造烟叶内部结构，在扫描电镜下放大合适倍数进而比较相应的纤维形状。由图5 可知，SH-01 纤维纵横交错、粗细不均，直径在2.90～10.34 μm之间。SH-02纤维表面存在褶皱，细碎烟粉颗粒较多，裸露出的纤维较细，直径在0.51～2.52 μm。SH-03 粗纤维直径在18.24～27.24 μm。CZ-01 纤维密度大、丝束细长且连接紧实，纤维直径在43.68～75.80 nm。通过对比可知，直径大小为SH-03＞SH-01＞SH-02＞CZ-01。研究表明纤维以互相缠绕为结合方式的再造烟叶具有较好的松厚度，比横纵交错的结构更加均匀，从而能够提高再造烟叶的品质［20］。3 种市售加热卷烟再造烟叶纤维较粗，可能是由不同生产工艺或是解纤不完全导致，而BC 重组再造烟叶能够有效将烟草基质与细菌纤维素结合，呈现出纳米纤维独特的超细网状结构，使重组再造烟叶呈现均匀致密的空间结构。由于纳米纤维的纤维直径远远小于其他加热卷烟专用再造烟叶，其参与重组再造烟叶后，BC 重组再造烟叶在20000倍电镜下观察仍然很少能够看到空间缝隙。

图5 不同放大倍数下再造烟叶纤维直径Fig.5 Images of fiber diameter of reconstituted tobacco at different magnifications

2.5 热性能分析

4 种再造烟叶的热重曲线（TG）、微商热重曲线（DTG）、差热分析曲线（DSC）分别见图6、图7、图8。将4种再造烟叶在加热过程中的热失重行为进行对比，总体上4种再造烟叶的热失重均表现为明显的4个阶段。

图6 4种再造烟叶热重曲线TG图Fig.6 Thermogravimetric curves of four reconstituted tobacco samples

图7 4种再造烟叶微商热重曲线DTG图Fig.7 Derivative thermogravimetric curves of four reconstituted tobacco samples

图8 4种再造烟叶差热分析曲线DSC图Fig.8 Differential thermal analysis curves of four reconstituted tobacco samples

阶段Ⅰ：温度区间55～125 ℃内相对失重为1.64%～4.60%。在80～100 ℃范围内DTG图出现1个较小极值峰，4种样品随温度变化质量损失较小。由DSC图可知，此阶段出现1个吸热峰，吸热量为0.37～11.52 J·g-1，这是由于试样中物质的热分解或蒸发所致，表现为水分和挥发性物质的损失［21］。

阶段Ⅱ：温度区间130～260 ℃内相对失重为22.18%～29.66%。SH-03 的质量损失最大，为29.66%；SH-02 的质量损失最小，为22.18%。在200～230 ℃范围内DTG 图出现1 个宽峰，在DSC 图上反映为1个较大的吸热峰和1个较小的吸热峰，总吸热量为1.04～5.10 J·g-1，通常伴随结晶融化、蒸发、升华等反应，主要表现为保润剂失重［22］（丙二醇、甘油添加量为15%～20%），同时伴随一些纤维素单糖晶体和小分子物质的熔融吸热，SH-02 的失重峰较小，可能和甘油添加量较少有关。

阶段Ⅲ：温度区间280～400 ℃内相对失重26.63% ～33.25%；SH-02 质量损失最大，为33.25%，CZ-01的质量损失最小，为26.63%。阶段Ⅱ、Ⅲ为主要失重阶段，在DTG 图中，阶段Ⅲ的失重峰相对较尖锐，即质量损失最大。在DSC 图上反映出1 个较大的放热峰，放热量为2.14～6.88 J·g-1，通常伴随结晶形态转变、氧化还原、化学分解等反应［23］，可能是由于碳骨架的断裂引起的纤维素分解、高沸点化合物和小分子物质（烟碱、香味物质）的热解，SH-01 的失重峰较大，推测其纤维含量较高。

阶段Ⅳ：温度400 ℃以上，质量损失趋于平稳且DTG图中4种再造烟叶的峰形趋于平缓。在DSC图上出现1个较小吸热峰，吸热量为0.15～0.73 J·g-1，说明温度超过400 ℃时，大部分物质已经分解或释放完毕，较小的失重可能是剩余未热解物质的进一步裂解和碳化［24］。

对单位质量的总吸热量进行比较，SH-01总吸热量为4.05 J·g-1，SH-02总吸热量为2.57 J·g-1，SH-03总吸热量为8.51 J·g-1，CZ-01总吸热量为9.52 J·g-1。表明细菌纤维素比植物纤维有着更强的吸热和持热能力，在温度区间内热反应更剧烈，有效传递的能量更多，有利于加热过程中物质的稳定释放。

2.6 化学成分分析

4 种再造烟叶水溶性总糖和烟碱含量（质量分数）见表2。由表2 可知，BC 重组再造烟叶（CZ-01）水溶性总糖和烟碱含量与市售再造烟叶相比处于较高水平，这是因为BC 重组再造烟叶（CZ-01）中添加了烟草浸提液发酵的细菌纤维素，纤维结构中附着的糖分和烟碱能够转移到再造烟叶中。通常再造烟叶的重要化学成分主要来源于选用的烟草原料和外源添加物质，受限于加工工艺。SH-01和SH-03造纸法再造烟叶受浸提流失和回涂率限制的影响，导致水溶性总糖和烟碱含量偏低。

表2 4种再造烟叶化学成分含量Tab.2 Contents of chemical components in four reconstituted tobacco samples

将4种再造烟叶在300～400 ℃下进行热裂解，考察其香味物质释放情况。由图9可知，在此温度段内4种再造烟叶的热裂解产物中含有较多的醛酮类、醇类、酸类、杂环类物质，较少的酚类、酯类、烃类、内酯类等香气前体物或致香成分，其中CZ-01 的香味物质种类最多，达45种，SH-03的种类最少，为38种。结合化学成分分析，BC重组再造烟叶相较于其他市售产品，总糖和烟碱的含量较高，香味物质一部分来自生物碱的热解和转化，如2，3'-联吡啶等，对烟气香味有明显的提升作用，并对刺激性有抑制效果；一部分来自糖类物质的热解，会生成呋喃类化合物（如2-乙酰基呋喃等），可增加坚果、烘烤、焦甜香韵［25］。

图9 4种再造烟叶香味成分种类分布Fig.9 Types of aroma components in four reconstituted tobacco samples

4 种再造烟叶在300～400 ℃热裂解出的香味物质见表3。由表3 可知，4 种再造烟叶的热裂解释放的香味成分各具特点。醛酮类化合物是影响烟草香味的重要物质，在CZ-01 中含量较高（14.23%～19.84%），SH-01 中含量较少（1.83%～7.94%）。热解产物中杂环类化合物含量最多，占香味物质总含量的30%以上，其中烟碱在300～400 ℃内转化和释放较完全。统计再造烟叶中9种共有香气物质的总量，即乙酸、羟基丙酮、糠醛、糠醇、苯乙醛、5-甲基呋喃醛、4，7，9-巨豆三烯-3-酮、4-羟基-β-二氢大马酮和9-羟基-4，7-巨豆二烯-3-酮，在4 种再造烟叶的香味成分总量占比分别为35.03%、41.67%、40.36%、62.39%，此外CZ-01 还含有异丁醛、异戊醛、苯乙酸等烟草本源香味物质［26］，有利于提高BC重组再造烟叶的香气水平。

表3 4种再造烟叶在300～400 ℃热裂解释放的香味物质Tab.3 Pyrolysis released aroma substances of four reconstituted tobacco samples at 300-400 ℃

表3 （续）

上述4 种再造烟叶的香味物质差异主要来源于不同的原料配方和工艺方法，造纸法再造烟叶的原料经浸提后内含物损失较多，回涂效果不理想，同时木浆纤维的引入还会带来杂气和苦味；稠浆法再造烟叶的香气成分较依赖外源添加的香精香料且再造烟叶干燥时带走大量水分，对香味物质的影响较大［4］；相对于市售产品，本研究中的CZ-01 并无外加香，其香味成分主要来源于BC 吸附的烟草发酵液，并且BC 纤维成分纯度高，热解时与香气协调无杂气，加之BC能够吸收和释放足够的热量促进烟草组织内部有效成分转化，因此在一定程度上能够说明该重组方式能够有效富集、保留和释放烟草香味物质，提高加热卷烟热源的利用效率，从而改善再造烟叶香气水平，提高产品质量。

3 结论

以烟草浸提液为底物，通过生物发酵合成细菌纤维素，并利用剩余烟草原料，重组制成了一种适用于加热卷烟的全烟草组分再造烟叶，通过对比分析，得到主要结论如下：①与3 种市售典型再造烟叶相比，BC 重组再造烟叶红外吸收特征相似，具有类似的官能团结构；扫描电镜显示BC重组再造烟叶中的超细纤维使其组织结构更加均匀，在不使用外加木浆纤维和黏合剂的条件下，能够保持较好的抗张强度。②BC重组再造烟叶热解时，单位质量的总吸热量最高，可为烟草材料稳定释放内含物质提供足够的能量。③BC 重组再造烟叶水溶性总糖含量为6.17%，烟碱含量达13.17 mg·g-1；热裂解释放的香味成分丰富，烟草本源香味物质种类多，特别是酮醛类致香物质释放量明显高于其他市售样品。