高烟碱K326 定向改良材料的创制与分析

郑淑心，闫筱筱，王召军，张洪映，崔 红

河南农业大学烟草学院，郑州市金水区文化路95号 450002

烟草生物碱是影响烟草品质的一类重要物质［1］。烟草生物碱主要分为烟碱、新烟碱、降烟碱和假木贼碱，其中烟碱含量（质量分数）占生物碱总量的90%～95%［2］。近年来，随着工业降焦技术的飞速发展，卷烟焦油量得到了有效控制，但同时卷烟产品的烟碱和致香物质含量也逐渐减少，导致卷烟产品的香气减弱［3-4］。而提高烟碱含量的烟叶可在降低焦油释放量的同时，最大限度地满足感官需求，受到工业企业的青睐。虽然，栽培措施对烟碱合成和积累有明显的调控作用［5-6］，但仅依靠肥料用量、留叶数来调控烟碱，无疑会导致烟叶发育不正常以及化学成分的不协调［7-8］。近年来，CRISPR/Cas9 技术已实现了在多个物种中的应用。在烟草中，也相继实现了单基因定点突变和多基因靶点敲除，均表明CRISPR/Cas9 基因编辑系统的有效性和可行性。因此，采用基因编辑技术对烟碱合成相关基因进行编辑，实现烟碱代谢的定向调控，对培育高烟碱烤烟品种具有重要意义。

生物碱的合成过程不仅受喹啉酸磷酸核糖基转移 酶（Quinolinic acid phosphoribosyl trandaferase，QPT）、腐 胺- N -甲 基 转 移 酶（PutrescineN-methyltransferase，PMT）、鸟氨酸脱氨酶（Ornithine decarboxylase，ODC）和PIP 家族还原酶（A622）等关键酶类催化调控，同时也受茉莉酸（JA）信号途径的调节［9］。JAZ 作为JA 途径信号模块（SCFCOI1-JAZMYC2）的关键抑制因子［10-11］，广泛参与调控植株免疫反应、生长发育和代谢物质的合成等过程，其中Zhang 等［12］、Howe 等［13］和Wang 等［14］的研究表明，烟草NtJAZ1参与调控烟碱的合成。另外，烟草JAZ基因沉默激活JA信号下游相关基因大量表达，显著提高植株对烟芽夜蛾的抗性［15］。但烟草NtJAZ1基因突变对烟草生长发育及品质的影响却鲜有报道。此外，拟南芥AtJAZ1基因在低温条件下能促进植株次生代谢的发生，提高植株的耐寒性，维持植株正常生长发育［16-17］。水稻JAZ可以调控碳水化合物的合成［18］，在JA介导的白叶枯病抗性反应过程中发挥重要作用［19］。过表达JAZ9的水稻转基因株系通过调控离子平衡等显著提高植株的耐盐性［20］。因此，以普通烤烟品种K326为材料，通过CRISPR/Cas9技术敲除NtJAZ1基因获得定向改良的高烟碱材料，并对其农艺性状、烟碱含量、腺毛密度和叶面化学成分等进行了分析，旨在为培育优质烟叶原料提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为本课题组保存的烤烟品种K326。K326 种子经消毒后播种在MS 培养基上，用于农杆菌的遗传转化。另外，K326突变材料播种于育苗盘上，按烟草行业标准进行育苗［21］，于2020年5月移栽种植于河南许昌隔离封闭试验田。田间种植和管理按照烤烟栽培技术流程［22］和当地优质烟叶栽培规程进行。

1.2 试验方法

1.2.1NtJAZ1基因敲除载体的构建

根据茄科基因组网站（https：//solgenomics.net/）已发表的烟草NtJAZ1基因两个拷贝的序列（Nitab 4.5_0000073g0270.1、Nitab4.5_0004234g0080.1），利用CRISPR2 在线软件（http：//crispr.hzau.edu.cn/CRIS PR2/）设计gRNA 序列：5′-GCAGTAGAAATAACTT CTTG-3′（341～360 bp），合成Oligo 二聚体后连上CRISPR/Cas9 基因敲除载体。将该载体转化根癌农杆菌EHA105 中，根据叶盘转化法对K326 无菌叶片进行农杆菌侵染，同时以空载体进行阳性对照试验。

提取突变体和对照幼苗DNA，通过PCR扩增和靶位点测序分析其序列突变情况，使用的引物如表1所示。

表1 扩增引物序列Tab.1 Amplification primer sequences

1.2.2 植物学性状调查

在烟株现蕾期，按照烟草行业标准方法［23］分别测量烟草K326和NK-9的株高、叶数、叶长、叶宽、茎围和节距等农艺性状指标，每个烟草株系测量10株。

1.2.3 烟碱含量测定

在现蕾期（移栽后60 d）、打顶期（移栽后75 d）、和成熟期（移栽后90 d），分别选取K326 和NK-9 的中部叶（从下向上数10～12 叶位）测定烟碱含量（质量分数）。将叶片置于105 ℃杀青1 h，在85 ℃烘干至恒质量。将叶片研磨后过0.250 mm 孔径的样品筛，称取200 mg样品于甲基叔丁基醚（MTBE）中萃取24 h，转移上清液至气相色谱-氢火焰离子化检测器（7890A，美国安捷伦公司）中，按照行业标准方法［24］进行烟碱含量的定量分析，重复3次。

1.2.4 腺毛形态观察与统计

分别选取K326 和NK-9 中长度约10 cm 的叶片进行腺毛形态和密度观察。使用质量体积分数为0.2%的罗丹明B 溶液染色20～30 min，用无菌水清洗后，放置于超景深显微镜（VHX-5000，日本基恩士公司）下进行腺毛形态拍照和密度统计。

1.2.5 叶面化学成分含量测定

分别挑选5株生长状况良好的K326和NK-9，取其中部叶进行叶面化学成分含量测定，重复3次。通过二氯甲烷浸提、无水硫酸钠搅拌干燥，用定量滤纸过滤至圆底烧瓶中。经旋转蒸发后加入1 mL 内标（2.020 mg/mL的八乙酸蔗糖酯+2.542 mg/mL的十七烷醇混合溶液）定容于棕色容量瓶中，在氮气保护下将溶剂吹干。然后，加入500 μLV（N，N-二甲基甲酰胺）∶V（N，O-双三甲硅基三氟乙酰胺）=1∶1 的溶液，在75 ℃水浴中进行衍生化反应。最后，分别加入N，O-双乙酰胺和吡啶125 μ L，即为GC/MS 分析样品液。将样品液置于GC/MS分析仪（HP-5890，美国赛默飞世尔科技有限公司）中进行化学成分的定性和定量分析，具体方法参考文献［25］。

1.2.6 常规化学成分含量测定

分别选取K326 和NK-9 的C3F 烟叶于75 ℃烘箱中烘干并研磨成粉，并过0.250 mm 孔径的样品筛，称取0.25 g 烟末于三角瓶中，加入25 mL 体积分数为5%的醋酸溶液，共振荡萃取30 min，定性滤纸过滤后作为待测液，用连续流动分析仪（AA3，德国水尔公司）按照行业标准方法［26-28］测定水溶性总糖、还原糖、烟碱、氯和钾含量（质量分数），重复3次。

1.2.7 中性香气物质测定

参照赵铭钦等［29］的方法测定烤后烟叶（C3F）中性香气物质含量。

1.2.8 生物碱合成相关基因表达分析

利用植物总RNA 提取试剂盒（DP4332，天根生化科技有限公司）分别提取K326 和NK-9 的根系总RNA，利用反转录试剂盒（NovoScript®ⅡReverse Transcriptase，上海近岸科技有限公司）合成cDNA第一链。根据NCBI GenBank 中的烟碱合成相关基因（NtMYC2a、NtMYC2b、NtPMT、NtQPT、NtODC和NtA622）序列，利用Primer Premier 5.0 软件设计荧光定量PCR 引物，上下游引物见表1，以L25（L18908）为内参基因。RT-PCR 反应程序：95 ℃2 min；95 ℃15 s，58 ℃15 s，72 ℃20 s，40个循环；溶解曲线：95 ℃15 s，58 ℃15 s，20 min 内升至95 ℃，95 ℃15 s。重复3 次。

1.2.9 数据处理

数据采用SPSS 17软件进行单因素方差分析，用最小显著差数法进行差异显著性检验，用Sigmaplot 14.0软件进行图表绘制。

2 结果与分析

2.1 高烟碱K326突变材料的创制和分子鉴定

通过农杆菌介导法将NtJAZ1基因敲除载体导入K326，经过潮霉素抗性筛选后，共获得22 株阳性植株。分别利用NtJAZ1-1和NtJAZ1-2特异引物（表1）进行PCR扩增和产物测序后发现10株的gRNA序列出现碱基突变，基因编辑效率为45.45%。突变情况分析表明，NtJAZ1-1靶位点序列发生突变的株系为NK-3、NK-4、NK-8、NK-9、NK-12、NK-15 和NK-17，NtJAZ1-2靶位点序列发生突变的株系为NK-3、NK-4、NK-6、NK-9、NK-12、NK-15、NK-19 和NK-22。其中，NK-9 中均为纯合突变，且NtJAZ1-1靶位点序列在1587～1641 bp 处缺失55 个碱基，NtJAZ1-2靶位点序列在1547～1548 bp 缺失2 个碱基（图1）。

图1 NK-9株系的分子鉴定Fig.1 Molecular identification of NK-9 line

为验证NtJAZ1基因敲除对烟碱合成的影响，采用RT-PCR对相关烟碱合成基因进行表达量分析，结果如图2 所示。图2 表明，与K326 相比，NK-9 中NtMYC2a、NtMYC2b、NtPMT和NtQPT的相对表达量明显提高，但NtODC和NtA622的相对表达量无显著变化。

图2 NK-9株系相关基因的相对表达量Fig.2 Relative expressions of genes of NK-9 line

2.2 NtJAZ1 基因敲除对植物学性状及叶面化学成分的影响

分别对植株形态和农艺性状进行观察与调查，结果见表2和图3A。与K326相比，NK-9生长良好，株高、叶数和叶宽显著高于对照K326，叶长显著低于K326，茎围和节距差异不显著。腺毛形态观察和密度统计分析结果见图3B，与K326相比，NK-9腺毛总数为77.29 根/mm2，降低14.62%，长柄分泌型腺毛数量降低20.19%。对叶面化学成分分析（图3C）发现，NK-9 的叶面化学成分总量为39.70 μg/cm2，西柏烷类二萜含量为34.43 μg/cm2，明显低于K326，分别降低23.71%和25.32%。这表明NK-9 生长发育良好，NtJAZ1具有调控腺毛发育和叶面化学合成分泌的功能。

表2 NK-9株系的农艺性状指标①Tab.2 Agronomic trait indexes of NK-9 line

图3 NK-9株系的田间生长发育状况Fig.3 Growth and development of NK-9 line in fields

2.3 NtJAZ1基因敲除对烟叶烟碱含量的影响

分别在现蕾期、打顶期和成熟期对烟叶进行烟碱含量测定，结果见图4。与对照K326相比，随着烟株的生长发育，NK-9 烟叶烟碱逐渐积累，在现蕾期显著提高33.26%，在打顶期和成熟期分别极显著提高36.41%和39.28%。由此可见，NtJAZ1基因敲除后促进了烟株中烟碱的合成。

图4 NK-9株系的烟碱含量Fig.4 Nicotine content of NK-9 line

2.4 NtJAZ1基因敲除对烤后烟叶化学成分的影响

2.4.1NtJAZ1基因敲除对常规化学成分的影响

选取C3F 等级烟叶进行常规化学成分测定，结果（表3）显示：与对照K326 相比，NK-9 烤后烟叶烟碱含量提高44.91%，差异达极显著水平，氮碱比和糖碱比偏低，总糖、还原糖、总氮、氯和钾含量在适宜范围内。

表3 烤后烟叶化学成分含量Tab.3 Contents of chemical components in cured tobacco leaves

2.4.2NtJAZ1基因敲除对中性香气成分的影响

对C3F 等级烟叶进行香气物质含量分析，结果（表4）显示：共检测出棕色化反应产物、类胡萝卜素类降解产物、苯丙氨酸类降解产物、西柏烷类降解产物和新植二烯五大类。

从表4 可以看出，与对照K326 相比，NK-9 烟叶的新植二烯含量提高35.02%，类胡萝卜素类降解产物含量总体上增加，棕色化反应产物总量和西柏烷类降解产物含量略有降低，中性香气物质总量略高，达1060.35 μg/g。说明NtJAZ1基因敲除株系中的新植二烯和中性致香物质总量明显提高。

表4 烤后烟叶中性香气物质含量Tab.4 Contents of neutral aroma components in cured tobacco leaves （μg·g-1）

3 讨论

本试验中通过CRISPR/Cas9 技术对K326 中NtJAZ1基因序列进行编辑，导致该基因发生移码突变，翻译提前终止，获得了NtJAZ1基因敲除材料NK-9。对NK-9 根系中烟碱合成基因的表达量分析发现，调控烟碱生物合成基因NtMYC2a、NtMYC2b、NtPMT和NtQPT的相对表达量出现不同程度增加，使NK-9株系在现蕾期、打顶期和成熟期的烟叶烟碱含量分别显著增加33.26%、36.41%和39.28%。这与Zhang 等［12］和Shoji 等［30］的研究结果一致，这些结果证明，NtJAZ1基因是烟碱生物合成调控的重要靶点之一。

在提高烟碱含量的同时，保证烟株正常的生长发育对于烟草品种定向改良至关重要。本研究中对NK-9株系的农艺性状进行分析，发现NtJAZ1基因失去功能后，基本不影响烟株正常的生长发育。虽然叶长与对照相比有所减小，但株高、叶数和叶宽显著提高，对烟叶生产并无严重的不良影响。荆叶醒等［31］在小麦研究中也发现，小麦TaJAZ1基因编辑后，植株生长发育状况良好。由此推测，NtJAZ1基因在应答茉莉酸甲酯（MeJA）信号调控次生代谢的同时，其功能缺失并不影响植株正常的生长发育。当然，由于烟株发育受栽培和多种环境因素的影响，NtJAZ1基因对烟株发育的影响还需要多年多点的试验进一步验证。

NtJAZ1基因在调控烟碱合成的同时，对烟叶其他化学成分也有一定影响。本研究中对获得的NK-9 株系烤后烟叶进行分析发现，NK-9 烟叶中性致香物质总量提高，其中新植二烯和类胡萝卜素类降解产物明显增加，这对烟叶品质有积极影响。但NtJAZ1基因的敲除也导致了烟叶叶面腺毛，尤其是长柄分泌型腺毛密度的减小，使腺毛分泌物，尤其是类西柏烷二萜化合物含量降低，最终导致了烤后烟叶中西柏烷类香气物质茄酮含量减少，这对烟叶品质有不利影响。关于JAZ家族基因调控腺毛发育方面，在拟南芥［32］、番茄［33］和青蒿［34］中已有报道，但NtJAZ1基因调控烟草腺毛发育的分子机制还需进一步研究。另外，可通过多性状聚合途径，在NtJAZ1敲除的植株上对腺毛密度进行定向改良，在保证烟碱高积累的同时，促进腺毛发育和分泌物的积累，从而提高烟叶品质。

4 结论

利用CRISPR/Cas9 技术获得了NtJAZ1基因敲除的定向改良株系NK-9。田间试验表明，NK-9 株系生长发育良好，在现蕾期、打顶期和成熟期中部叶片烟碱含量分别提高33.26%、36.41%和39.28%，烤后烟叶烟碱含量提高44.91%，中性致香物质总量显著增加。这表明NtJAZ1基因敲除能显著增加烟叶烟碱含量，促进烟叶中性致香物质的积累，是进行烟碱含量定向改良的重要靶点。