基质金属蛋白酶-1、基质金属蛋白酶-3、基质金属蛋白酶-9主要基因位点多态性与缺血性脑血管病的相关性分析

黄奕平，俞 敏，张丽君

(深圳市龙岗中心医院神经内科，广东 深圳 518000)

脑血管病具有较高的发病率、致残率以及致死率，是导致人类死亡的第二大原因，据不完全统计数据显示，2015年因脑血管疾病死亡的人数已突破650万，预计到2030年死亡率可能突破780万[1-2]。受人口老龄化的影响，脑血管病的发病人数与日俱增，严重威胁人类的生命安全，已受到广大医务工作者的共同关注。且随着近年来相关研究的不断深入，越来越多的学者发现基质金属蛋白酶(MMPs)可能在脑血管病的发生、发展过程中起着至关重要的作用[3]。MMPs主要是指以组含有可降解细胞外基质的蛋白酶，目前主要是按照结构以及底物特异性的差异将其分作明胶酶(如MMP-2与MMP-9)，基质溶解素(如MMP-3与MMP-7)，间质胶原酶(如MMP-1与MM-2)等[4]。且有研究报道显示：MMPs会对血管基质产生严重损害，继而干扰脑血管的完整性，同时对血脑屏障造成损伤，可能加剧脑损伤的发生[5]。鉴于此，本文通过研究MMP-1、MMP-3、MMP-9主要基因位点多态性与缺血性脑血管病的相关性，旨在为脑血管病的治疗寻求新的靶点，并为脑血管病患者的预后及生活质量改善提供参考依据，进一步减少社会对脑血管病治疗所支出的巨大医疗成本。

1 对象与方法

1.1一般资料：选取2016年7月～2020年10月我院收治的短暂性脑缺血发作(TIA)患者100例以及急性脑卒中患者100例作为研究对象，分别作为TIA组以及卒中组。另选取同期体检的健康志愿者100例作为对照组。TIA组男63例，女37例；年龄34～78岁，平均(58.93±3.55)岁；体重指数(BMI)19～28 kg/m2，平均(22.52±2.10)kg/m2；基础疾病：高血压71例，糖尿病56例；吸烟58例，饮酒40例。入选标准[6]：①均经相关检查确诊为TIA；②年龄均已超过40岁；③并无其他脑血管病；④无恶性肿瘤或(和)自身免疫性疾病。TIA判定标准：局灶性脑功能损害症状和体征在24 h内(多数1 h内)完全恢复；急性发作性病程(多在2～3 min)；符合TIA发作时神经系统的症状和体征。卒中组男65例，女35例；年龄33～79岁，平均(58.84±3.56)岁；BMI 20～28 kg/m2，平均(22.59±2.15)kg/m2；基础疾病：高血压72例，糖尿病53例；吸烟55例，饮酒41例。入选标准：①均为急性发作；②病程不足2周；③头颅CT、MRI确诊；④以往未发生过脑血管病；⑤年龄均已超过40岁；⑥无恶性肿瘤或(和)自身免疫性疾病。对照组男67例，女33例；年龄32～79岁，平均(58.89±3.59)岁；BMI 20～28 kg/m2，平均(22.61±2.13)kg/m2；基础疾病：高血压69例，糖尿病51例；吸烟54例，饮酒42例。入选标准：①年龄均已超过40岁；②无脑血管病或恶性肿瘤或其他自身免疫性疾病等。两组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。具有可比性。本研究获得医院伦理委员会批准。

1.2研究方法：①血清MMP-1、MMP-3、MMP-9及Vaspin、Chemerin水平水平检测：血液标本采集时机选择为清晨空腹状态，采集静脉血量为3 ml，实施时长为10 min的3 000r/min离心处理，获取血清保存备用。通过酶联免疫吸附法完成上述各项血清学指标水平的检测，具体操作务必遵循试剂盒说明书进行。试剂盒均由深圳晶美生物科技有限公司提供。②基因位点测定：MMP-1基因型检测：基因位点为C-161T，基因型包括C/C(野生纯合子)、C/T(突变杂合子)、T/T(突变纯合子)。第一步即以酚-氯仿抽提法自外周血有核细胞内提取基因组DNA，随后完成PCR扩增PPAR-γ2基因Pro12Ala多态性片段操作。上、下游引物序列分别为5'-CAAGCCCAG TCCTTTCTGTG-3'、5'-AGTGAAGGAATCGC TTTCCG-3'。反应参数：95℃预变性5 min，95℃变性45 s，54℃退火30 s，72℃延伸40 s，35个循环，末次循环72℃ 7 min。反应在PCR扩增仪上完成(购自美国Bio-Rad)。然后以PCR-RFLP法完成多态性的检测，纯化处理PCR产物后经限制性内切酶HpaⅡ(购自美国Promegar公司)酶切，酶切位点为C/C GG。37℃水浴酶解4 h，经8%非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳，EB染色后读取基因型;MMP-3基因型检测：基因位点为rs3025058，基因型包括5A纯合子、6A纯合子以及5A/6A杂合子。基因检测方式与MMP-1基因相同，上、下游引物序列分别为5'-CTTCCTGGAATTCACATCACTGCCACCACT-3'、5'-TTCCCCCATEAAAGGAATGGAGAACC-3';MMP-9基因型检测：基因位点为SNP rs 3918242，基因型包括C/C纯合子、T/T纯合子以及T/C杂合子。基因检测方式与MMP-1基因相同，上、下游引物分别为5'-GCCTGGCACATAGATGGCCC-3'、5'-CTTCCTAGCCAGCCGGCATA-3'。③血清Vaspin及Chemerin水平检测。

1.3观察指标：比较三组血清MMP-1、MMP-3及MMP-9水平和基因型情况；分析血清MMP-1、MMP-3及MMP-9水平诊断TIA效能的受试者工作特征(ROC)曲线。

2 结果

2.1三组血清MMP-1、MMP-3及MMP-9水平评价：TIA组血清MMP-1、MMP-3及MMP-9水分别为(122.34±8.15)μg/L、(93.21±8.03)μg/L、(132.74±8.37)μg/L，明显高于卒中组的(86.83±6.29)μg/L、(57.22±5.71)μg/L、(110.42±5.23)μg/L，且卒中组上述各项指标水平均高于对照组差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 三组血清MMP-1、MMP-3及MMP-9水平评价

2.2血清MMP-1、MMP-3及MMP-9水平诊断TIA效能的ROC曲线分析：血清MMP-1、MMP-3及MMP-9水平联合诊断TIA的曲线下面积、敏感性及特异性均高于上述三项指标单独检测。见表2。

表2 血清MMP-1、MMP-3及MMP-9水平诊断TIA效能的ROC曲线分析

2.3三组MMP-1、MMP-3及MMP-9基因型情况评价：TIA与卒中组MMP-1/C-161T基因型CC人数占比相较于对照组显著更高，而CT、TT人数占比相较于对照组明显更低差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 三组MMP-1、MMP-3及MMP-9基因型情况评价[n(%)，n=100]

2.4三组血清Vaspin及Chemerin水平对比：TIA组、卒中组血清Vaspin水平均低于对照组，且TIA组血清Vaspin水平低于卒中组；TIA组、卒中组血清Chemerin水平均高于对照组，且TIA组血清Chemerin水平高于卒中组差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 三组血清Vaspin及Chemerin水平对比

3 讨论

TIA和脑卒中是临床上较为常见的神经系统疾病，具有发病率高、致残率高以及致死率高的特点，根本病因为脑部血氧供应缺乏[8-9]。相关研究报道证实，该类患者存在一定程度的脑组织局部动脉血流减少，因此脑组织往往发生缺血、缺氧，继而导致神经功能出现损伤，预后不良[10-12]。相关研究报道显示，早期预测TIA及脑卒中是改善患者预后的关键，亦是目前临床医务人员共同关注的热点[13-15]。迄今为止，临床上针对脑血管病的影像学检查手段包括超声、磁共振成像以及CT等，患者一旦发生明确的影像学变化，往往提示脑血管状况较差，预后不良。由此可见，寻求一种更为积极、有效的缺血性脑血管病早期诊断方式显得尤为重要，亦是目前临床研究的热点。

MMP-1相较于MMPs家族其他成员而言，具有较高的表达，主要作用是对人体内丰富的Ⅰ型、Ⅲ型胶原组织起到明显的降解作用，可能参与了脑血管病的发病过程，并在其中发挥着至关重要的作用[16]。MMP-3是MMPs家族中另一重要酶，主要是通过影响其他MMPs活性以及功能的途径，进一步介导脑血管病的发生、发展。临床一项关于MMP-3单核苷酸多态性的研究证实[17]，SNP和冠状动脉粥样硬化程度以及心肌梗死的风险性密切相关。且体内外的试验结果证实[18]：MMP-3在血管组织内高表达于5A纯合子，低表达于6A纯合子，且5A纯合子人群相较于6A纯合子人群而言，动脉粥样硬化程度显著增加。MMP-9则是目前国内外研究最多的一种MMPs，已被证实其活性和单核苷酸多态性不但和脑血管疾病的发生、发展存在密切相关，亦和全身动脉硬化有一定联系。本研究发现，TIA患者血清MMP-1、MMP-3及MMP-9水平存在明显高表达，且联合检测上述三项血清学指标水平诊断TIA的效能较高。究其原因可能是MMPs可对血管基质造成一定程度的破坏，同时影响脑血管的完整性，损伤血脑屏障，继而引起脑损伤的加剧。张丽君等人已得到与本研究相似结果[19]：TIA患者以及脑卒中患者的血清MMP-1、MMP-3及MMP-9水平均明显高于健康人群，且TIA患者的上述各项指标水平均高于脑卒中患者。此外，本研究发现MMP-1基因多态性可能和缺血性脑血管病密切相关，但MMP-3及MMP-9基因多态性和缺血性脑血管病无关。考虑原因可能是MMP-1/C-161T基因会促进动脉粥样硬化过早进入不稳定状态，进一步促进了缺血性脑血管病的发生、发展。这在俞敏等人的研究报道中得以佐证[20]：MMP-1基因多态性可能和缺血性脑血管疾病有关。本文结果还显示，TIA组、卒中组血清Vaspin水平均低于对照组，且TIA组血清Vaspin水平低于卒中组；TIA组、卒中组血清Chemerin水平均高于对照组，且TIA组血清Chemerin水平高于卒中组。Vaspin可通过调节磷脂酰肌醇3-激酶/Akt信号通路，继而减少有利脂肪酸诱导的内皮细胞凋亡，同时抑制P34/hap27信号通路，减少活性氧产生，从而抑制血小板原生长因子所引起的平滑肌细胞迁移，进一步抑制疾病的发生、发展。Chemerin属于机体内的关键性代谢性影响因子，其异常表达可通过影响脂质代谢紊乱，继而增加低密度脂蛋白对动脉血管内皮细胞的浸润，进一步导致粥样硬化或动脉关闭狭窄发生。

综上所述，血清MMP-1、MMP-3及MMP-9水平联合检测可用作TIA的临床诊断，且MMP-1基因多态性可能和缺血性脑血管病密切相关，而MMP-3及MMP-9基因多态性和缺血性脑血管病无关。此外，血清Vaspin、Chemerin表达的异常可能在缺血性脑血管病发生、发展过程中发挥至关重要的作用，其具体作用机制有待进一步研究证实。