基于生物信息学鉴定膝关节骨性关节炎滑膜炎性反应的关键基因和通路

陈 鹏，赵 超，胡 珍，陈继明

(1.江西省都昌县中医院，江西 九江 332600；2.江西省都昌县人民医院，江西 九江 332600)

膝骨关节炎(KOA)是最常见的骨关节退行性病变，主要病理表现为软骨退变、滑膜炎性反应及软骨下硬化和骨赘形成[1-3]。据报道全球约有2.4亿人患有KOA[4]。软骨损伤被认为是导致KOA进展的关键病理因素[5]。但是，随着医学的飞速发展，人们越来越认识到滑膜炎性反应在KOA发病中的关键作用[6-8]。 Mancarella等[7]提出滑膜炎性反应驱动了KOA病理过程中的软骨损伤。同时，许多临床研究表明，滑膜炎性反应与KOA症状如关节疼痛、僵硬和软骨损伤显著相关[9-10]。因此，了解滑膜炎性反应的病理过程在KOA的治疗中有重要作用。

随着现代生物医学的发展，越来越多的证据表明KOA的发生和发展是由多种基因和信号通路介导的。在过去的十年中，高通量技术已经报道了有关KOA基因表达谱研究的大量数据，并揭示了许多差异表达基因(DEG)涉及不同的途径，生物过程(BP)或分子功能(MF)[11]。生物信息学方法可以整合多个基因表达谱的数据，使人们能够研究KOA中mRNA表达的变化以及DEG之间的相互作用，从而为进一步的KOA研究提供了新的见识。因此，本研究旨在通过生物信息学分析法鉴定KOA滑膜组织中涉及的生物标志物和通路，在分子水平上为KOA进展提供新的见解。

1 资料与方法

1.1数据集下载：在Gene Expression Omnibus(GEO)数据库中以'knee osteoarthritis'为检索词检索KOA滑膜组织的测序数据集，得到GSE55235和GSE55457两个基因表达数据集，两个数据集均使用GPL96平台处理。GSE55235和GSE55457共含有40个滑膜组织，包括健康关节的20个滑膜组织和KOA关节的20个滑膜组织。两个数据集的详细信息可见表1。

1.2DEG的筛选和鉴定：使用R软件中的RPA[12]和sva软件包[13]避免批次效应，通过ggpolt2软件包[14]进行箱形图验证了两个数据集的规范化。使用limma软件包[15]分析确定DEG，以| log2(倍数变化)|>1和P<0.05为差异具有统计学意义的DEG。使用火山图和热图显示具有统计学意义的DEG。 使用R软件中的ggplot2和pheatmap软件包[16]生成火山图和热图，显示具有统计学意义的DEG。

1.3功能和途径富集分析：GO富集分析[17]从三个方面来描述基因功能和关系的概念，即BP，细胞组分(CC)和MF。使用DAVID数据库[18]对DEG进行GO和KEGG通路富集分析，然后使用R软件进行可视化。P<0.05为差异具有统计学意义。

1.4蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络的构建和模块分析：使用STRING数据库[19]构建蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络。选择相互作用评分>0.4的DEG在Cytoscape软件中进行可视化。使用MCODE插件进行子模块分析，以鉴定更多连接的基因组[20]。标准设置如下：MCODE分值>5，节点数>6。并同时对子模块进行功能和通路富集分析。P<0.05为差异具有统计学意义。本次研究经过本院医学伦理委员会同意。

2 结果

2.1数据集的归一化：GSE55235和GSE55457均从GEO数据库下载的，并使用RPA和sva软件包用于规范化数据并避免批处理效应。见图1A所示，方框图显示的黑线基本处于同一水平；主成分分析(PCA)显示，对照组和OA组存在明显的聚类，各组之间存在显著差异。见图1B。

注：A为对DEG进行归一化后的箱线图，黑线所示的箱线图基本处于同一水平，这表明两个数据集的患者是统一且可比的，两者之间的偏差很小；B为所有纳入样本的主成分分析(PCA)，在对照组和OA组中均显示出明显的簇，两组之间存在显著差异

2.2鉴定具有统计意义的DEG：使用limma软件包对比正常组与OA组滑膜组织中的DEG。见图2所示，总共观察到279个DEG，包括133个基因被上调和146个基因被下调。图3显示了所有上调和下调的DEG的热图。

注：红点表示上调的基因，蓝点表示下调的基因，黑点表示无统计学差异的基因

注：红色表示较高的基因表达，蓝色表示较低的基因表达

2.3DEG的GO和KEGG通路富集分析：见图4所示，GO富集分析结果显示，在生物学过程(GO-BP)上，DEGs主要富集在“免疫反应”，“细胞黏附”和“炎性反应”等；在分子功能(GO-MF)上，DEG主要通过调节“肝素结合”，“丝氨酸型内肽酶活性”和“抗原结合”发挥分子功能；在细胞组分上，DEG主要在“细胞外囊泡”，“细胞外区域”和“细胞外空间”中显著富集。

图4 DEG的前10个GO富集结果

DEG的KEGG通路富集分析结果见图5所示，提示DEGs主要通过“类风湿性关节炎”，“TNF信号传导途径”，“破骨细胞分化”和“ECM-受体相互作用”等途径发挥重要作用。

图5 DEG的前20条KEGG通路富集分析结果

2.4PPI网络构建和hub基因筛选：使用STRING数据库构PPI网络，并选择相互作用评分>0.4的具有统计学意义的DEG在Cytoscape软件中进行可视化处理，见图6。排名前20位的hub基因包括细胞白介素(IL)-6，原始原癌基因(JUN)，CXC基序趋化因子配8(CXCL8)，血管内皮生长因子A(VEGFA)，核因子κB抑制剂α(NFKBIA)，基质金属蛋白酶(MMP)1，MMP9等。表1列出了前20个hub基因的详细信息。在这些基因中，IL-6，JUN和VEGFA具有最高的节点度，表明其在滑膜炎性反应过程中起关键作用。

表1 前20个hub基因的详细信息

红色表示较高程度的基因，黄色表示较低程度的基因

2.5子模块分析:在PPI网络中共鉴定出两个MCODE分值>5且节点数>6的模块。模块1(MCODE分数=6.438)包括33个节点，模块2(MCODE分数=5.111)包括10个节点。KEGG通路分析结果如图7A和B所示，结果表明模块中的DEG在“IL-17信号通路”，“ECM-受体相互作用”，“破骨细胞分化”，“NF-κB信号通路”中显著富集。IL-17信号通路在两个模块中均显著富集，提示其可能在OA发展过程中起关键作用。

图7 DEG的子模块的通路富集分析。

3 讨论

随着医疗技术的飞速发展，已将许多方法用于治疗KOA，包括物理疗法、非甾体类抗炎药、关节镜和关节置换术等。不幸的是，目前没有办法有效地逆转或阻止KOA的进展[21]。全膝关节置换术(TKA)被认为是治疗终末期KOA的最后选择，但TKA也存在诸如感染、翻修、功能不满意等并发症[22-23]。因此，研究骨关节炎的发病机理并寻找治疗KOA的有效方法一直是研究的重点。过去一般认为滑膜炎性反应被认为是由软骨磨损导致的碎片引起的[24]。但是，最近的研究[25]显示，滑膜炎性反应可以被认为是骨关节炎的先兆，在放射学检查发现软骨损伤之前就已经存在。此外，有学者认为滑膜和脂肪膜下垫可被视为解剖功能单元，在KOA发生过程中加速软骨损伤并引起疼痛[26]。因此，探索滑膜炎性反应的发病机制可能为KOA的治疗提供新的视角。

本文纳入了两个GEO数据集，并使用生物信息学方法分析了279个DEG，包括133个上调基因和146个下调基因，并进行了GO和KEGG通路富集分析，以探索DEG在KOA进展过程中的生物学机制。KEGG通路富集分析结果显示DEG主要在“类风湿关节炎”，“TNF信号途径”，“PI3K-Akt信号途径”和“破骨细胞分化”等通路富集，这与先前发表的文章相似[27-29]。GO富集结果显示DEG主要富集在了“免疫反应”，“细胞黏附”和“炎性反应”等生物学过程。先前的研究表明，先天和后天免疫系统在OA过程中起关键作用[30]，并表明骨关节炎是一种炎性反应性疾病[31]。有趣的是，GO-CC分析结果显示DEG主要富集在“细胞外囊泡”，“细胞外区域”和“细胞外空间”。外泌体是30-150 nm大小的细胞外囊泡，带有脂质双层膜，其中包含许多生物活性物质，如非编码RNA、蛋白质和mRNA，在细胞间通讯中起重要作用[32-34]。这些DEG可以通过滑膜分泌到外泌体中，并被关节周围的组织(如软骨和脂肪垫)吸收，然后放大炎性反应并加重软骨损伤，这进一步解释了滑膜炎性反应在OA中的关键作用。

此外，本文构建了DEG的PPI网络，并使用Cytoscape软件进行可视化并根据自由度鉴定hub基因，结果显示 IL-6，JUN和VEGFA具有最高的自由度。IL-6是一种炎性细胞因子，参与各种生物过程，包括炎性反应、免疫反应以及癌症[35]。IL-6启动子区的多态性引起欧洲人对类风湿性关节炎的易感性[36]，并与老年人骨关节炎的严重程度和功能状态有关[37]。托珠单抗是一种IL-6抑制剂，可减轻OA引起的中枢敏化和慢性疼痛，并保留关节软骨并增加骨量[38-39]。JUN是另一个hub基因，AP-1是JUN的激活蛋白，可以通过多种刺激调节，包括炎性细胞因子，氧化应激等[40]。许多MMPs启动子包含潜在的AP-1结合位点，并且被细胞因子激活的AP-1也可以调节MMP表达。Tang等[41]提出c-JUN/AP-1信号通路调节人滑膜成纤维细胞中IL-6的表达。VEGFA是VEGF家族的创始成员，通常被称为VEGF[42]。VEGF在骨骼发育和骨重构中起着调节血管生成的关键作用，并被怀疑在OA的发病机理中起着关键作用[43]。膝关节内注射VEGF可诱导OA样变化，如关节软骨降解、蛋白聚糖丢失、滑膜炎性反应以及软骨下硬化[44]。临床证据表明VEGF水平升高与OA进展有关[42,45]。最近的临床前研究也显示抑制VEGF可有效预防OA的关节破坏并减轻相关疼痛[42]。

最后，PPI网络的子模块分析表明，OA的发展与“IL-17信号通路”，“ECM-受体相互作用”，“破骨细胞分化”，“NF-κB信号通路”等相关。IL-17信号通路在这两个模块中都显著富集，提示其可能在OA过程中起关键作用。IL-17主要由Th17细胞产生，Th17细胞是CD4+T细胞的一个亚群，主要参与诱导自身免疫和炎性疾病[46]。Liu等[47]发现与对照组相比，IL-17在OA中的表达明显更高患者，并阻断IL-17信号通路可延迟与OA相关的疼痛。同时，IL-17信号通路可以激活NF-kB和MAPK通路，而这些通路与OA的发展密切相关[48]。基质金属蛋白酶(MMPs)是一种促进软骨分解，降解细胞外基质(ECM)成分并在OA中起重要病理作用的酶家族[49]。许多文章使用MMPs的表达水平来反映OA中软骨损伤的程度，尤其是MMP-1、-3和-9[50-52]。PTGS2是与炎性反应相关的基因，在骨关节炎中高度相关[53]。NFKBIA、FOSB和JUND都与NF-kB和MAPK信号通路密切相关，它们在OA的病理过程中起着至关重要的作用[54-55]。

综上所述，本研究在OA滑膜炎性反应过程中鉴定出279个DEG，这些DEG显著富集在“风湿性关节炎”，“TNF信号传导途径”，“PI3K-Akt信号传导途径”和“破骨细胞分化”等通路。GO-CC的结果提示滑膜将DEGs释放至外泌体，在KOA的信号传递中起关键作用，并加剧KOA进展。IL-17信号通路可能是治疗KOA的重要靶标。