Ael亚型基因多态性研究

李晓菲 张烨 刘婷婷 苗天红 许志远

截至2021年2月国际输血协会（ISBT）已经确认了43个红细胞血型系统。ABO血型系统是最早发现且临床最重要的红细胞血型系统。ABO血型抗原是糖链结构，血型基因通过控制不同的糖基转移酶合成不同的糖蛋白，形成A、B、O、AB四种表型。由于ABO血型基因的多态性，碱基突变、缺失、插入、重组以及拼接错误，都会影响糖基转移酶的活性和特异性，从而影响A、B抗原的表达，这就是ABO亚型形成的原因[1]。Ael亚型是比较稀有的ABO亚型，血清学仅能通过吸收放散试验检测[2]。利用分子生物学的方法，现已发现Ael亚型有多种不同的基因型。本中心收集并鉴定了9例Ael/AelB亚型血液样本，发现了4种Ael基因型，现报道如下。

材料与方法

1 标本来源 从2020年11月～2021年9月由医院输血科送至本中心进行疑难血型鉴定的血液标本中，收集经血清学方法鉴定为Ael/AelB亚型的标本，共9例。样本收集及相关试验的开展均已通过北京市红十字血液中心医学伦理审查委员审批（编号：2020-005-002）。

2 试剂与仪器 抗-A、抗-B血型定型试剂（上海血液生物医药有限公司，20201216），人ABO血型反定型试剂红细胞（上海血液生物医药有限责任公司，20215315），抗-AB（Immucor，301601），抗-H（Sanquin，8000452618），人源抗-A、抗-B（中国医学科学院输血研究所，20200816），人类ABO血型基因分型检测试剂盒-荧光PCR法（江苏伟禾生物，202104A），MagCore®核酸提取试剂盒（RBC Bioscience，MGB400-03）；MagCore®Super全自动核酸提取仪（RBC Bioscience，MCA1602），荧光定量PCR仪（ABI，QuantStudio3），PCR扩增仪（ABI，ProFlex PCR System），微量分光光度计（北京美林恒通仪器有限公司，SMA4000），恒温震荡金属浴（北京路科顺高新技术有限公司，Thermomixer），离心机（日本久保田，KA-2200）。

3 血清学试验 ABO血型鉴定采用试管法、吸收放散试验，操作流程参考文献[3]。Ael/AelB亚型的血清学格局正定型表现为O型/B型，反定型表现抗-A弱或不能检出抗-A，通过试管法检测常呈现出正反定不符的现象。产生这种血清学格局的原因有很多，可通过增加检测试剂如抗-AB、抗-H以及开展吸收放散试验来辅助血型鉴定。

4 基因检测 EDTA抗凝全血中提取DNA，将DNA浓度调整至50 ng/μL，于–40℃保存备用。利用人类红细胞ABO血型基因分型试剂盒检测A、A205、B、OT、O1、O2等位基因，进行基因型初步判定。通过基因测序技术检测ABO血型基因第6、第7外显子，引物序列参考文献报道[4]。以A101为参考序列，使用Geneious（11.1.4版本）软件进行序列比对和分析。

结果

1 ABO血型血清学结果 试管法ABO血型正反定型及吸收放散试验结果见表1。9例样本吸收放散试验阳性，表明红细胞上有弱A抗原。通过血型血清学结果可判断1～7号为A亚型，8～9号为A亚B型。

表1 9例血液样本血清学实验结果

2ABO血型基因检测结果 利用实时荧光定量PCR检测9例标本的ABO血型基因型，均检出A基因，结果见表2。通过序列比对与分析，共发现4种Ael基因型，分别为Ael02（3例）、Ael04（1例）、Ael05（4例）和Ael10（1例），具体发生突变的碱基位点及氨基酸变化见表3，序列突变位置见图1。

图1 Ael亚型测序结果

表2 9例血样样本基因检测结果

表3 4种Ael基因型突变位点

讨论

Ael亚型是指红细胞与抗-A和抗-AB不发生凝集，仅能通过吸收放散试验检测到弱A抗原，血清中常能检测到抗-A1[3]。根据输血相容性检测标准，在无法获得同型血液时，Ael亚型患者可选择O型洗涤红细胞，A型或AB型血浆输注。在本次收集的9例Ael/AelB亚型样本中，只在9号标本红细胞上检测到了弱的A抗原，其余均不能与抗-A发生凝集反应，经鉴定该标本基因型为Ael05/B101，有文献报道[5]由于等位基因间的增强作用，AelB型人红细胞可能与某些单克隆抗-A发生弱的凝集，类似B（A）血型。在9例Ael/AelB亚型中，部分样本血浆中存在弱的抗-A，由于检测试剂的不同以及个体差异，有些未能检出抗-A或者抗-A的效价有微弱差异。另外，9例样本利用吸收放散试验均检出弱A抗原，血清学结果表明为Ael/AelB亚型。利用实时荧光定量PCR的方法对9例标本进行初步基因分型，结果与测序相符。通过序列比对与分析，进一步明确了每种Ael对应的等位基因及突变情况。

现已报道的Ael亚型等位基因共有12种[6]，具体见表4。同一种Ael亚型血清学格局，可以由不同的基因突变引起。ABO基因位于第9号染色体，共包含7个外显子，6个内含子，编码区全长1062 bp。其中负责A型/B型糖基转移酶催化功能的区域主要集中在第6、第7外显子，Ael亚型的突变高发区多在第7外显子。

表4 Ael基因多态性位点比较

在本次收集并鉴定的9例Ael/AelB亚型中，共发现了4种Ael基因型：Ael02、Ael04、Ael05和Ael10。其突变机制分别为基因重组、剪切拼接错误、点突变以及移码突变。在这9例Ael/AelB亚型中Ael02型检测到了3例，发生频率较高。据文献报道[7]Ael02型多发生在日本人，主要通过A102与O02这两个等位基因在第7外显子发生基因重组产生，其中碱基位646T＞A的突变是导致酶活性减弱的主要原因。同样通过基因重组产生的还有Ael07[8]，其重组也是发生在A102与O02这两个等位基因之间，形成A1v-O1v杂交基因，829G＞A处突变导致了A型糖基转移酶活性的减弱，产生了Ael表型。

Ael04型检测到1例，该基因型最早在中国台湾发现并报道[9]，其基因突变位点发生在第6内含子+5G＞A。虽然突变位置不在编码区，但此处突变导致转录过程中剪切拼接发生错误，造成第5、第6外显子缺失，使合成的糖基转移酶在N末端缺失了57个氨基酸，从而减弱了酶活性，造成了A抗原的弱表达[10]。

Ael05型最早由中国学者报道[11]，主要发生在中国，在本研究中共检测到4例，发生频率较高。767T＞C的碱基替换导致编码的氨基酸在256位由异亮氨酸（Ile）突变为苏氨酸（Thr），改变了A型糖基转移酶的活性。另外，通过点突变形成Ael亚型的基因型还有Ael06，其在425C＞T发生突变[12]，以及Ael11在955C＞G处发生突变[13]。

Ael10型是2019年报道的一种Ael亚型等位基因[1]，在本文中也检测到1例，其突变发生在碱基序列959～963区间，5个连续的碱基C之间插入了一个C，导致合成的氨基酸序列从322位发生移码突变，终止密码子后移，增加了34个氨基酸，从而影响了酶的催化活性，导致A基因的弱表达。同样通过移码突变影响酶活性形成Ael亚型的还有Ael01、Ael03、Ael08、Ael12。其中Ael01是1995年由OLSSON等[14]最先报道的Ael亚型等位基因，突变主要发生在798～804区间7个连续碱基G之间插入单碱基G，导致合成的氨基酸序列从269位发生移码突变，终止密码子后移，增加了37个氨基酸，影响了酶活性的表达，该等位基因多发生在欧洲人。随后报道的Ael08型[15]也发生了相同的突变，两种等位基因的区别在于Ael08同时存在467C＞T的碱基替代，467C＞T多发生在A102，该突变对酶活性几乎没有影响，A102在中国人中出现频率远高于A101[16]，而Ael08也多发生在中国人。另外，Ael03（804delG）以及Ael12（816insG）也分别在不同碱基位点通过缺失或插入单碱基使碱基序列发生移码突变[17-18]。

除了上述4类Ael亚型的形成机制外，还有文献报道[19]了Ael09型，其突变发生在第2外显子，在52C＞T处发生碱基替换，导致终止密码子提前出现，无法翻译出完整的氨基酸序列。但其在红细胞上仍能吸收放散出弱A抗原，原因可能是在突变形成的终止密码子下游出现的甲硫氨酸仍可作为起始密码子重新起始翻译过程，合成活性减弱的糖基转移酶，最终在血清学上表现为Ael亚型。

不同等位基因产生的Ael亚型可能源于不同的分子机制，但都催化相同的反应，在红细胞表面合成痕量的A抗原，在血型血清学上也都呈现相同的ABO血型表现格局。通过对ABO血型基因的序列分析，可知Ael亚型具有丰富的基因多样性，而且突变并不都发生在酶的活性中心，也可能在非活性位点通过影响糖基转移酶的空间构象改变酶的活性。通过对Ael亚型基因分型的研究，有助于我们了解上游基因水平上的改变如何影响下游蛋白质的合成，进而影响酶的活性，这对后续探索ABO亚型所引起的糖基转移酶功能的改变具有重要意义。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突