探索不同Rh表型细胞与一种抗CD47单克隆抗体 TJC4结合的血清学特征

权军辉 张明刚 吴姣姣 赵景杰 韩梅宁

CD47单抗是治疗肿瘤的一种新型靶向药物，于2020年9月在中国进入Ⅲ期临床试验[1]。TJC4（TJ011133，临床登记号：NCT 03934814）是一种针对CD47靶点的创新全人单克隆抗体，与其他CD47单抗药物一样，同属IgG4亚型肿瘤治疗靶向药物，不仅与肿瘤细胞上高度表达的CD47抗原结合，阻止“不要吃我”信号的形成，促进巨噬细胞对肿瘤的吞噬，同时可干扰输血相容性试验造成患者血型鉴定或配血困难[1-2]。文献报道：CD47抗原所有细胞均有表达，但不同Rh表型细胞表达剂量不同，ccdee表达量最高，其次是ccDEE，D-少量或微量表达，Rh null几乎不表达[3-5]。本研究旨在探索不同Rh表型细胞与TJC4结合的血清学特征，报道如下。

材料与方法

1 一般资料 西安交通大学第二附属医院常规就诊患者中随机选取Rh表型分别为CCDee、CcDEe、CcDee、ccDEE、ccDEe、ccdee、Ccdee、CCdee的A型患者（前4种表型各5例，后4种表型各3例）作为研究对象。纳入标准：1）非肿瘤且无严重基础疾病；2）所研究各Rh表型抗原均符合血清学检测“4+”标准；3）CT、核磁等影像学及相关实验室检查结果均可排除肿瘤相关疾病。排除标准：1）肿瘤及与肿瘤相关基础疾病者；2）Rh表型相关抗原血清学检测非标准“4+”者；3）影像及实验室相关检查无法排除肿瘤相关疾病者等。该研究已通过西安交通大学第二附属医院伦理委员会审批（获批伦理号：XY2021001-EC-1），所涉及药物TJC4及相关试剂的使用权限均已征得资助方同意。

2 仪器与试剂 37℃恒温水浴箱（HH-US-A，江苏新春兰科学仪器有限公司）、离心机（ID-Centrifuge 12 S Ⅱ，BIO-RAD，达亚美有限责任公司）、保温箱（ID-Incubator 37 S Ⅰ，BIO-RAD，达亚美有限责任公司）、离心机（KA-2200，日本久保田公司）、EDTA-K25 mL抗凝管（批号：210305，浏阳市三力医用科技发展有限公司）、低离子抗球蛋白卡（批号：50531.62.12，达亚美有限责任公司）、生理盐水（批号：M21041102C，四川科伦药业股份有限公司）、Anti-A、B（IgM单克隆抗体）（批号：20210406，上海血液生物医药有限责任公司）、Anti-D（IgM单克隆抗体）（批号：20211803，上海血液生物医药有限责任公司）、Anti-D（IgG单克隆抗体）（批号：20200826，上海血液生物医药有限责任公司）、人ABO血型正/反定型和Rh（D）血型检测卡（柱凝集法）（批号：113210702，天津德祥生物技术有限公司）、人Rh系统分型检测卡（柱凝集法）（批号：131G210902，天津德祥生物技术有限公司）、凝聚胺试剂（批号：A210201，珠海贝索生物技术有限公司）、抗筛谱细胞（批号：20217022，上海血液生物医药有限责任公司）、TJC4（批号：2120S19Aa，I-Mab公司）、独特型抗体ID-ab 9F9H11H811（批号：RD210207300，I-Mab公司）、Gamma N-HANCE（批号：335023，IMMUCOR公司）、Immucor AHG（批号：702026-1，IMMUCOR公司）、AHG（批号：20195002，上海血液生物医药有限责任公司）。

3 方法

3.1 不同Rh表型细胞与TJC4结合的血清学特征研究

3.1.1 试验样本 EDTA-K2分别抽取每位研究对象静脉血5 mL；

3.1.2 体外致敏 每个Rh表型EDTA-K2抗凝全血标本2925（975×3）μL加TJC415（5×3）μL（终浓度200 μL/mL全血）混匀，37℃孵育1 h，分离红细胞和血浆备用；

3.1.3 对比观察并分析致敏前后各研究对象ABO血型鉴定及Rh分型相关检测指标有无变化；

3.1.4 ID-ab中和取400 μL药物致敏血浆分别加入两个独特型抗体ID-ab管（70 μL ID-ab/管，ID-ab独特型抗体浓度为1.632 mg/mL），37℃孵育1 h，备用；

3.1.5 微柱凝胶法、盐水法、聚凝胺法、血型鉴定、DAT、IAT及交叉配血试验严格按第四版《全国临床检验操作规程》[6]及《临床输血技术规范》[7]规范操作；

3.1.6 Immucor AHG去干扰以上海生物AHG为对照，试管法分别取致敏血浆、1%浓度致敏红细胞每管100 μL做DAT、IAT、交叉配血试验。对照组各加入100 μL上海生物AHG，试验组各加入100 μLGamma N-HANCE（LISS增强剂）37℃孵育30 min后洗涤1次弃上清，再各加入Immucor AHG100 μL，3000 r/min离心1 min观察结果。

3.2 ccDEe和ccdee表型细胞致敏血浆与独特型抗体ID-ab中和剂量差异研究。

3.2.1 取ccDEe和ccdee表型细胞致敏血浆各100 μL、100 μL、50 μL分别对应加入40 μL、70 μL、70 μL独特型抗体ID-ab管（规格同上），37℃孵育1 h，备用；

3.2.2 分别取ccDEe和ccdee表型上述三种比例的ID-ab中和血浆各25 μL×3加入微柱凝胶卡，与1%浓度抗体筛查谱细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各50 μL×337℃保温箱孵育15 min后，1500 r/min离心10 min观察结果。

结果

1 本研究所纳入研究对象EDTA-K2抗凝全血经CD47单抗TJC4体外致敏前后ABO血型鉴定及Rh分型检测相关指标变化如表1所示：1）致敏前所有研究对象ABO血型鉴定正反一致且均达到血型鉴定标准判定规格，而致敏后出现正反不符（主要体现在反定型上）；2）Rh分型检测指标影响不明显；3）反定型盐水法与微柱凝胶法检测结果略有差别。

表1 致敏前后各研究对象ABO血型鉴定及Rh分型相关检测指标

续表1

2 不同Rh表型细胞与CD47单抗TJC4结合的血清学特征如表2所示：1）该研究所纳入所有Rh表型细胞致敏后DAT、IAT、交叉配血试验结果均呈不同凝集强度阳性，且交叉配血主侧凝集均略强于次侧；2）Rh表型为CCDee、CcDEe、CcDee、ccDEE、Ccdee、CCdee时，致敏血浆中的CD47单抗TJC4能够被独特型抗体ID-ab所中和，而Rh表型为ccDEe ccdee时，致敏血浆中的CD47单抗TJC4则不能够被独特型抗体ID-ab所中和；3）Immucor AHG LISS增强法能够去除CD47单抗TJC4对所有Rh表型细胞的干扰。

表2 不同Rh表型红细胞与TJC4结合的血清学特征

3 ccDEe和ccdee表型细胞致敏血浆与独特型抗体ID-ab中和存在剂量差异，即在同种浓度[致敏血浆：ID-ab=10:4（100:40）、10:7（100:70）、10:14（50:70）]下加大独特型抗体ID-ab中和剂量可达到消除CD47单抗TJC4对ccDEe 和ccdee表型细胞的干扰。

讨论

文献报道[8]：CD47又称整合素相关蛋白（integrin-associated protein，IAP），本质跨膜糖蛋白，广泛存在于各种细胞膜表面且以非共价键连接，是重要的红细胞表面标记，能与巨噬细胞表面抑制受体蛋白（singal-regulatory protein alpha， SIRPa）结合并激活SIRPa胞内受体酪氨酸抑制膜序（immunoreceptor tyrosine inhibitory motif，ITIM）使其磷酸化，从而阻止巨噬细胞对靶细胞的吞噬，即巨噬细胞对靶细胞的吞噬作用与细胞膜表面CD47表达与否及其表达剂量均相关，不表达不影响，表达且表达剂量越多抑制作用越明显。巨噬细胞属免疫细胞，源自单核细胞，由骨髓前体细胞发育而来，通过免疫应答既可阻止机体免受各种侵害，亦可因防御过度而使机体发生炎性反应，一般机体免疫多处于自稳状态，倘若细胞表面CD47抗原过度表达，机体就会因巨噬细胞结合靶细胞功能降低而发生各种肿瘤样难治性疾病。

表3 ccDEe和ccdee表型致敏血浆与ID-ab中和剂量

TJC4具有差异化特质，拥有独特结合表位，为IgG4亚类抗体，通过阻断CD47通路使肿瘤得以被巨噬细胞吞噬，可最小程度与正常红细胞结合且不产生凝聚作用，属Ⅰ类治疗用生物制品，适用于复发或难治性急性髓系白血病（AML）或骨髓增生异常综合征（MDS），2019年4月26日获得国家药品监督管理局（NMPA）默示许可，2019年6月24日被宣布已在美国完成临床研究首例患者给药，2019年7月31日在中国医学科学院血液病医院首次通过伦理委员会审查，2020年3月25日国内临床研究第一例招募患者签署知情同意书并于2020年4月2日入组，目前仍在临床研究阶段[9-10]。

正常机体虽无肿瘤样恶性疾病发生，但不同Rh表型细胞表面CD47抗原表达存在剂量差异，当其分别与一定量CD47单抗结合时，必然存在抗体不足、等量、过量三种情况。抗原过量抗体不足或抗原抗体等量时，致敏血清中不会有游离抗体检出，抗原不足抗体过量时，致敏血清中则会有游离抗体检出。本研究即证实：1）使用CD47单抗TJC4后，可因患者血清中游离抗体的存在而致ABO血型鉴定时正反不符；2）所有Rh表型细胞与CD47单抗TJC4结合后同一试验不同方法间存在明显差异，这与不同试验方法间本身差异性相关；3）不同Rh表型细胞与CD47单抗TJC4结合后经同等浓度不同剂量独特型抗体ID-ab中和后亦存在明显差异，即独特型抗体ID-ab中和试验ccDEe、ccdee表型与CCDee、CcDEe、CcDee、ccDEE、Ccdee、CCdee表型达到相同的血清学试验结果所需独特型抗体ID-ab中和剂量存在差异，说明独特型抗体ID-ab中和试验可消除CD47单抗对输血相容性试验的干扰，但不同Rh表型间所需其中和剂量不同；4）缺乏IgG4检测功能的Immucor AHG试剂LISS增强剂法能够消除本研究中TJC4对所有Rh表型细胞所造成的血清学干扰，这与CD47单抗本身属IgG4亚类抗体的特性相关[11]。

综上所述，该研究的临床意义在于明确：1）所有Rh表型细胞与TJC4结合后均存在ABO血型鉴定正反不符（TJC4干扰反定型）、交叉配血主次不合（主侧明显）、DAT和IAT阳性等特征，且不同实验方法间存在明显差异；2）消除TJC4对输血相容性试验的干扰，不同Rh表型细胞患者处理方法略有不同，主要体现在ccDEe和ccdee表型ID-ab中和试验需加大独特型抗体ID-ab剂量。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突