妊娠期高血压疾病患者胎盘组织叶酸代谢基因MTR的表达水平及其作用机制研究

王 维，唐 静，杨永红，薛 峰

（1.成都市龙泉驿区妇幼保健院 a.检验科；b.妇产科，成都 610100;2.四川大学华西医院龙泉医院检验科，成都 610100）

妊娠期高血压疾病是妊娠相关疾病。子痫前期（preeclampsia，PE）是严重的妊娠并发症之一，全球约有4%～5%的妊娠妇女受其影响，全身多系统受累，重者将导致严重母婴不良事件的发生[1-3]。随着孕周增加，滋养层细胞将从增殖型转化为侵袭型，利于胎盘着床。而胎盘滋养细胞迁移侵袭能力缺陷将导致胎盘浅着床，促进妊娠期高血压疾病的发生[4]。相关研究发现叶酸代谢异常，相关基因多态性与妊娠期高血压疾病的发生具有一定的相关性[5]，子痫前期患者胎盘组织中甲硫氨酸合成酶(methionine synthase，MTR)的表达显著增加。MTR 是叶酸代谢的关键基因之一，催化同型半胱氨酸的再甲基化，形成甲硫氨酸以及S-腺苷甲硫氨酸（S-Adenosylmethionine，SAM）[6]。甲硫氨酸[7]及SAM[8-9]均被报道具有抑制细胞的迁移及侵袭能力，提示MTR 的表达异常可能参与妊娠期高血压的胎盘浅着床过程。本研究将进一步研究MTR 对上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）相关基因的调控作用以及对滋养层细胞HTR8 细胞迁移侵袭能力的影响。以期从叶酸代谢的角度探究妊娠期高血压疾病的发病机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象 HTR8 人绒毛滋养层细胞株购于美国ATCC 细胞库。2018年1月～2020年12月在成都市龙泉驿区妇幼保健院分娩的30 例妊娠期高血压疾病、28 例子痫前期和20 例重度子痫前期患者及25 例正常产妇作为研究对象。各组病例比较年龄及身体质量指数（body mass index，BMI）差异无统计学意义（均P＜0.05），具有可比性，见表1。纳入标准为：单胎妊娠，剖宫产终止分娩。妊娠期高血压标准为妊娠20 周以后出现收缩压≥140 mmHg 和/或舒张压≥90 mmHg；子痫前期标准为妊娠期高血压患者出现蛋白尿(尿蛋白 ≥0.3 g/24 h或随机尿蛋白≥+)；重度子痫前期标准为子痫前期患者出现收缩压≥160 mmHg 和/或舒张压≥110 mmHg。排除标准：原发性高血压、既往心肝肾及内分泌系统疾病、胎膜早破、早产、感染。本研究已取得伦理委员会批准同意及患者知情同意。

表1 各组病例基线资料比较（± s）

表1 各组病例基线资料比较（± s）

项目对照组（n=30）妊娠期高血压（n=28）子痫前期（n=20）重度子痫前期（n=25）FP年龄（岁）28.50±1.5329.12±0.7930.50±2.329.80±1.643.471＞0.05 BMI（kg/m2）21.8±1.422.1±0.920.5±1.222.3±0.85.310＞0.05

1.2 仪器与试剂 DMEM/F12 细胞培养液，胎牛血清（FBS），0.25g/dl 胰蛋白酶（100ml PBS, 0.25g胰酶），100 U/ml 浓度青霉素＋链霉素，lipofactemine2000，TRIzol 试剂（美国Invitrogen 公司）；基质胶（康宁公司）；引物合成项目（上海生工生物工程股份有限公司）；RNA 反转录试剂盒（Prime Script RT Reagent Kit），real-time PCR 试剂盒（SYBR Premix Ex Taq II）（日本Takara 公司）；MTR siRNA（上海吉玛制药技术有限公司）；MTR，ZEB1，E-Cadherin 和GAPDH 一抗（Abcam 公司）。

1.3 方法

1.3.1 标本采集及细胞培养：采集研究对象分娩5min 内母体面胎盘组织（避开血块、梗死及钙化），PBS 洗净后保存于液氮中。HTR8 人绒毛膜滋养层细胞株培养于含10g/dl FBS 的DMEM/F12 培养液中，并添加100 U/ml 浓度青霉素＋链霉素。

1.3.2 siRNA 转染：本研究所涉及MTR-siRNA 由吉玛基因设计、合成、验证。使用Lipofactemine3000进行转染，详细步骤参考产品说明书，48h 后进行后续实验，包括抽提RNA，real-time PCR，Transwell 实验。

1.3.3 细胞和组织中RNA 抽提及qRT-PCR： 使用TRIzol 法提取细胞RNA 并检测浓度，反转录为cDNA 后进一步进行qRT-PCR。qRT-PCR 程序使用产品说明书推荐程序。本实验涉及引物序列如下：GAPDH（人），F-5’-TGTGGGCATCAATGGATTTG G-3’，R-5’- ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3’；MTR（人），F-5’- AGCGGGAGAAGCTAAACGAA G-3’，R-5’- CGGTAGGCCAAGTGTTCAAGG-3’；E-Cadherin（人），F-5’- CGAGAGCTACACGTTCA CGG -3’，R-5’-GGGTGTCGAGGGAAAAATA GG-3’；ZEB1（人），F-5’- GATGATGAATGCGAGT CAGATGC -3’，R-5’- ACAGCAGTGTCTTGTT GTTGT-3’。以GAPDH表达量作为内参，并使用2-ΔΔCt值计算靶基因的相对表达量。

1.3.4 Western blotting：使用RIPA 提取细胞总蛋白，BCA 法蛋白定量后进行SDS-PAGE 电泳。使用PVDF 膜湿转法进行转膜，5g/dl 脱脂奶粉封闭1 h 后加入一抗4℃孵育过夜。次日，TBST 洗膜后加入相应种属的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h 后使用ECL 发光法检测蛋白表达量。

1.3.5 细胞迁移及侵袭试验：将1∶5 稀释的基质胶铺于Transwell 的上层小室中，成膜后进行侵袭实验（迁移实验无需使用基质胶）。上层小室中加入约5×104个细胞的无血清培养基，下层小室加入含20% FBS 的完全培养基。培养48h 后取出Transwell小室，经PBS 清洗，4%多聚甲醛固定后使用结晶紫染色，棉签拭去上层未迁移细胞后显微镜观察拍摄，统计各组细胞迁移、侵袭的情况。

1.4 统计学分析 应用GraphPad Prism 6.0 统计软件行统计学分析，制图、数据以均数±标准差（±s）表示，两样本均数比较均采用t检验，多样本均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTR 和EMT 相关基因在胎盘组织中的表达见表2，图1。与对照组相比，随着妊娠期高血压疾病分期的进展，胎盘组织中MTR mRNA 的表达量逐渐增加，子痫前期与重度子痫前期患者胎盘组织中E-Cadherin 的表达增加，妊娠期高血压疾病患者胎盘组织中ZEB1 的表达量下降，差异具有统计学意义（均P＜0.05）。随着疾病分期进展，MTR及E-Cadherin 的蛋白表达量明显增加，而ZEB1 的蛋白表达量明显降低。

表2 胎盘组织中MTR 基因，EMT 相关基因的相对表达量（± s）

表2 胎盘组织中MTR 基因，EMT 相关基因的相对表达量（± s）

注：妊娠期高血压 vs 对照组tZEB1=-4.920，P ＜0.05；子痫前期 vs 对照组tMTR=10.143，tE-Cadherin=8.327, tZEB1=-5.372, 均P ＜0.05；重度子痫前期 vs 子痫前期、妊娠期高血压组相比，tMTR=20.160, tE-Cadherin=9.437，tZEB1=-9.352，均P ＜0.05；子痫前期vs 妊娠期高血压tMTR=7.564，tZEB1=-4.214, 均P ＜0.05；重度子痫前期vs 妊娠期高血压tMTR=10.253, tE-Cadherin=6.297，tZEB1= -7.986，均P ＜0.05；重度子痫前期 vs 子痫前期组tMTR=18.984，tE-Cadherin=10.841，tZEB1=-13.938，均P ＜0.05。

项目对照组（n=30）妊娠期高血压（n=28） 子痫前期（n=20）重度子痫前期（n=25）FP MTR1.00±0.331.18±0.341.72±0.172.58±0.1367.1＜0.000 1 E-Cadherin1.00±0.301.08±0.221.14±0.35 1.53±0.4113.28＜0.000 1 ZEB1 1.00±0.220.77±0.120.48±0.100.13±0.0665.41＜0.000 1

图1 胎盘组织中MTR，E-Cadherin 和ZEB1 的蛋白表达变化

2.2 敲低MTR 表达对HTR8 细胞EMT 基因表达的影响 见表3。siRNA 可以显著抑制HTR8 中MTR 基因mRNA 的表达，敲低MTR 基因后可显著抑制上皮相关标志物E-Cadherin 基因mRNA的表达, 可以显著促进间充质相关标志物ZEB1基因mRNA 的表达，差异有统计学意义（均P＜0.05）。

2.3 敲减MTR 表达对HTR8 细胞的迁移及侵袭的影响 见图2 及表4。敲减HTR8 细胞中MTR 基因可显著促进迁移能力，侵袭实验结果显示敲减MTR 基因可促进HTR8 细胞的侵袭能力，差异均具有统计学意义（均P＜0.05）。

表3 MTR 对E-Cadherin，ZEB1 表达的调控作用（x± s）

图2 敲减MTR 对于滋养细胞迁移及侵袭的影响（标尺=200μm）

表4 MTR 对HTR8 迁移及侵袭的调控作用（x± s 个/HP）

3 讨论

许多研究均提示叶酸代谢关键基因MTR 与妊娠期高血压疾病具有一定的关联性，叶酸代谢异常可能参与该疾病的发生[10]。SEREMAKMROZIKIEWICZ 等[10]人检测子痫前期患者胎盘组织中叶酸代谢相关基因的表达情况，包括亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）、甲硫氨酸合成酶、甲硫氨酸合成酶还原酶（methionine synthase reductase，MTRR）及胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine gamma-lyase，CSE），发现子痫前期患者胎盘组织中MTR 的表达显著增加，MTRR 的表达显著降低，MTHFR 没有明显变化，提示差异基因MTR 可能参与妊娠期高血压疾病的发生。SHIN 等[11]人进一步研究相关基因于胎盘的定位，发现正常胎盘组织表达MTR 及MTHFR，MTR 主要表达于滋养层细胞，而MTHFR 主要表达于基膜的细胞团簇中，在滋养层细胞中并无特异性表达。这些结果均提示MTR的特异性异常表达有可能参与滋养层细胞功能缺失，影响滋养细胞的迁移及侵袭能力，导致胎盘浅着床。但SHIN 等[11]人发现MTR 的蛋白表达在对照组与妊娠期高血压组（定义为孕20 周后收缩压≥140mmHg 和/或舒张压≥90mmHg）患者胎盘组织中的表达没有显著差异。鉴于妊娠期高血压疾病是一组疾病，本研究分别统计了对照组、妊娠期高血压组、子痫前期、重度子痫前期患者胎盘中的基因表达差异。本研究结果同样发现，MTR 及E-Cadherin mRNA 在对照组与妊娠期高血压组间无显著差异，但随疾病进展表达上升，重度子痫前期组胎盘中mRNA 及蛋白的表达量明显上调，提示MTR 参与的叶酸代谢异常可能参与妊娠期高血压疾病发展过程中发挥一定的作用。另外，研究报道[12]叶酸代谢基因相关基因多态性与高血压易感性相关，MTR 2756A＞G 具有作为高血压相关生物标志物的潜在价值。MTR 2756A ＞G 还与高同型半胱氨酸血症具有一定的相关性，可能参与高血压的发生机制[13]。但是在妊娠期高血压患者中，目前尚未找到具有统计学意义的MTR 基因多态性位点，比如MTR 2756A ＞G[14]，进一步详细的分层可能有助于发现更具有差异性的MTR 多态性位点。

在胎盘形成过程中，滋养层细胞发生上皮-间质转换是重要的环节之一。该过程中滋养细胞失去上皮表型，获得迁移侵袭能力更强的间充质表型，促进子宫螺旋动脉的重塑，增加胎盘灌注，利于胚胎发育[15]。研究发现子痫前期胎盘组织中EMT 相关基因表达异常，上皮标志物E-Cadherin 上调，间质标志物ZEB1 下调，且阿斯匹林可通过miR-200/ZEB1 轴调控滋养细胞功能[16-17]，提示滋养细胞EMT 过程的变化可能参与妊娠期高血压疾病的发生与进展，同时也是潜在的防治靶点之一。本研究结果与之相符，发现随着妊娠期高血压疾病的进展，胎盘组织中上皮标志物E-Cadherin 的mRNA 及蛋白表达上调，胎盘组织中间充质标志物ZEB1 的mRNA 及蛋白表达下调，提示胎盘滋养细胞侵袭能力减弱。通过转染MTR-siRNA 发现，MTR 具有负向调控滋养层细胞EMT，迁移侵袭的能力，进一步提示MTR 通过调控滋养细胞EMT 过程参与妊娠期高血压疾病的发生，导致胎盘浅着床的发生。

MTR 是叶酸代谢的关键基因之一，同时参与甲硫氨酸以及S-腺苷甲硫氨酸的生成。我国学者发现，孕期补充叶酸并不能降低发生子痫前期的危险性，但是该研究可能受到样本量等因素的影响[18]，增加样本量或更为详细地分层分析可能会得出更有差异的结果。目前尚无关于MTR 基因直接调控EMT 以及细胞侵袭、迁移能力的研究，本研究发现通过siRNA 敲低MTR 表达后可以促进滋养层细胞的迁移及侵袭能力，进一步发现MTR 可以调控EMT 相关基因及蛋白的表达。MTR 调控细胞EMT过程及运动能力的机制可能与叶酸代谢中间产物相关。MTR 的表达及活性增强将促进甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸的含量，参与疾病的发生。众多研究发现甲硫氨酸及SAM 具有抑制细胞迁移侵袭的能力。SAM 可通过miRNA-34c 和miRNA-449a 抑制三阴乳腺癌细胞的增殖及迁移能力[8]。在肝癌模型中，额外补充甲硫氨酸同样可以发挥抑制肿瘤细胞迁移侵袭的作用[7]。这些结果均提示叶酸代谢异常在细胞的侵袭转移过程中具有重要的作用，同时也是重要的治疗靶点，后续的研究将进一步挖掘叶酸代谢过程中相关代谢产物对于子痫前期发病的影响以及与妊娠期高血压疾病的临床相关性。另外高同型半胱氨酸血症是心血管疾病的独立危险因素，研究发现叶酸代谢相关基因的甲基化程度与高同型半胱氨酸血症具有一定的相关性，我国学者发现MTHFR 位点TT 基因型与高同型半胱氨酸血症具有相关性[19]，但尚未有MTR 位点SNP 与高同型半胱氨酸血症、妊娠期高血压疾病的相关性研究。而且随着年龄增长MTR 基因启动子区域的甲基化程度增加[20]。今后将会从多方面研究妊娠期高血压疾病中叶酸代谢基因表达异常的分子机制（如甲基化异常，SNP），筛选与疾病进展、预后相关的代谢物，改善该病的母婴结局。