肺结节组织中Caspase3和Caspase9蛋白表达在良恶性诊断及肺癌临床病理特征中的价值研究

陈敬信，王小玲

（1.陕西省森工医院病理科，西安 710300；2.渭南市第二医院病理科， 陕西渭南 714000）

肺癌为全球发病率最高的恶性肿瘤之一，多由肺结节发展而来。尽管多数肺结节为良性，但是也有部分结节是早期肺癌，因此对于肺结节进行早期定性诊断具有重要价值[1]。影像学可对肺结节的形态学改变进行整体判断，肺结节的病灶比较小，恶性征象更少，导致常规影像学诊断效果不佳[2]。细胞凋亡是通过基因控制的细胞的自主死亡，产生这一现象的主要原因是由一系列具有高度调控的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteine aspastic acid-specific protease , Caspase）通过级联反应形成的[3]。Caspase 3 是Caspase 家族最重要的效应成员之一，其主要负责调控细胞凋亡的下游，使细胞内的底物进行降解导致细胞死亡，从而利于机体处于平衡状态[4]。据以往报道显示，对于淋巴上皮组织恶性程度以及预后情况可通过Caspase 3 水平判断，其对肺癌的诊断与治疗也起到了一定作用，在侵袭性肺癌细胞中的表达上调[5]。Caspase 9 作为参与内质网介导细胞凋亡的生物标志分子，在多种癌细胞的凋亡中均起到了一定的作用。聂美玲等[6]研究显示，血清Caspase 9 可介导神经母细胞与宫颈癌细胞的凋亡。本文具体探讨了肺结节组织中Caspase 3 和Caspase 9 蛋白良恶性诊断中的价值，希望避免该病的过度诊断及治疗。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2018年1月～2020年7月在陕西省森工医院诊治的肺结节患者86 例作为研究对象，纳入标准：①患者年龄20 ～70 岁；②病灶直径0.4 ～1.5 cm，符合肺结节的诊断标准(经手术切除后病理证实)；③预计生存时间≥3 个月；④具有完整临床及影像学资料；⑤研究得到了医院伦理委员会的批准。排除标准：①并发其他部位肿瘤的患者；②临床及影像学资料缺乏者；③妊娠与哺乳期妇女；④心肺功能不全，肝肾功能严重障碍。

86 例患者中，病理诊断为良性结节46 例（良性组），恶性结节40 例（恶性组）。见表1。两组的性别、年龄、体重指数、结节部位等对比差异均无统计学意义（均P＞0.05），结节最大径对比差异有统计学意义(P＜0.05)。

另外，在恶性组中，组织学分化：高分化26 例，中分化8 例，低分化6 例；病理类型：鳞癌21 例，腺癌19 例；淋巴结转移19 例；临床分期：Ⅰ期22例，Ⅱ期10 例，Ⅲ期8 例。

表1 两组患者一般资料对比

1.2 仪器与试剂 免疫组织化学试剂盒，EVOS 成像系统（美国赛默飞世尔科技有限公司）；多克隆抗体Caspase 3 和Caspase 9（英国Abcam 公司），倒置光学显微镜（德国徕卡公司）。

1.3 方法

1.3.1 蛋白表达检测：采用免疫组织化学染色法对肺结节组织中Caspase 3 和Caspase 9 阳性表达情况进行检测，其工作浓度分别为1∶500 和1∶200，阴性对照采用磷酸盐缓冲溶液（取代一抗），阳性对照采用已知的阳性切片。

将病理组织进行石蜡包埋并切片，脱蜡水化后进行清洗，封闭处理后分别加入Caspase 3 蛋白一抗和Caspase 9 蛋白一抗溶液，4℃ 孵育1 天后，对应二抗溶液常规孵育30 min。清洗后进行DAB 显色，苏木素复染后封片。按照染色强度+阳性细胞百分数进行综合积分，无染色为0 分，浅染色为1 分，棕黄色为2 分，深棕色为3 分；没有阳性细胞为0分，低于10 %的阳性细胞为1 分，10 %～50 %的阳性细胞为2分，50%～100%的阳性细胞为3分。综合积分≥4 分为阳性表达。

1.3.2 调查内容：调查患者的病历资料，包括姓名、性别、年龄、体重指数、病理类型、临床分期、组织学分化、淋巴结转移、结节最大径、结节部位等。

1.4 统计学分析 数据分析选择SPSS20.00，计量数据用均数±标准差（±s）表示，行t检验；计数数据用n(%)表示，行χ2检验，采用Pearson 相关进行相关性分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 两组患者Caspase 3 和Caspase 9 表达阳性率对比 恶性组肺结节组织中Caspase 3[28(70.0%)]和Caspase 9[33(82.5%)]表达阳性率均显著高于对照组[6(13.0%)，7(15.2%)]，差异均有统计学意义(χ2=29.035, 39.932，均P＜0.05)。

2.2 不同病理特征患者的Caspase 3 和Caspase 9 表达阳性率比较 见表2。不同病理类型患者肺结节组织中Caspase 3 和Caspase 9 表达阳性率比较，差异均无统计学意义（均P＜0.05）。恶性组中，不同淋巴结转移、组织学分化、临床分期患者肺结节组织中Caspase 3 和Caspase 9 表达阳性率对比，差异具有统计学意义(均P＜0.05)。

表2 不同病理特征患者的Caspase 3 和Caspase 9 表达阳性率比较[n=40，n（%）]

2.3 恶性结节Caspase 3 和Caspase 9 表达阳性率与病理特征的相关性 见表3。Pearson 相关性分析显示组织学分化、淋巴结转移、临床分期与肺结节组织中Caspase 3 和Caspase 9 表达阳性率均呈正相关(均P＜0.05)。

表3 恶性结节Caspase3 和Caspase9 表达阳性率与病理特征的相关性(n=40)

3 讨论

肺结节是人类较为常见的呼吸道病变之一，肺结节多是一种边界清楚或模糊、单发的结节病变，由于居民年龄增加与病毒感染等因素的影响，肺恶性结节在我国的发病人数逐年增加[7-8]。现代研究表明Caspases 3 对细胞凋亡的过程起到决定性作用[9]。而细胞凋亡又是一个复杂的过程，Caspases家族的激活是细胞凋亡发生机制中最关键的环节之一。Caspases 家族由两部分构成，分别为起始型Caspases 与效应型Caspases，其中Caspase 9 属于起始型Caspases，其主要职能是启动凋亡和调节效应型Caspases 的活性；而Caspase3 属于效应型Caspases，其主要职能是对细胞凋亡的执行者与终结者。尤其是经过激活的Caspase 3，可通过降解多种底物直接使细胞发生凋亡[10]。本研究表明肺癌细胞多伴随有Caspase 3 和Caspase 9 的高表达。不过也有研究认为Caspase 3 水平明显下降，这可能与肺癌的恶性程度、异质化程度有关，同时还发现肺癌患者若出现Caspase 3 蛋白表达缺失，则更加容易发生淋巴结转移，而且伴随有预后不良[11-12]。

早期肺癌以肺结节形成存在，随着病灶不断增大，该病的恶性特征越明显。肺癌的形成是一个由正常细胞逐渐向恶性转化的过程，这是通过多阶段、多因素、长期相互作用形成的，可在多种基因（如抑制凋亡基因、促凋亡基因、凋亡效应基因等）共同作用下调控肿瘤细胞的凋亡[13-14]。从机制上分析，Caspase 3 和Caspase 9 蛋白均为执行细胞凋亡较为重要的因子，主要通过级联效应导致细胞凋亡。而癌症的临床分期、淋巴结转移、组织学分化等均可能是Caspase 3 和Caspase 9 异常表达的影响因素，其表达的异常可能促进了癌症的发生、发展过程[15]。本研究Pearson 相关性分析显示恶性肺结节的组织学分化、淋巴结转移、临床分期与Caspase 3 和Caspase 9表达阳性率都存在相关性，从机制上分析，细胞凋亡的过程主要是由Caspase 家族进行调控的，其中Caspase 9 可在凋亡信号传导的多个途径中发挥作用[16-17]。

Caspase 3 一般情况是以酶原的形式存在于胞浆中，当发生细胞凋亡时则立即被激活，激活后由两个大亚基和两个小亚基组成，然后将胞浆胞核底物进行裂解，使细胞发生凋亡[18]。同时本研究还有不足之处，如样本量相对较小，未从基因表达水平方面探讨两者与良恶性结节间是否存在差异，将在后续研究中深入分析。

总之，Caspase 3 和Caspase 9 蛋白在恶性肺结节中呈现高表达状况，也与患者的病理特征存在相关性，有利于肺结节良恶性的临床鉴别诊断。