miR-219a-5p在癫痫患儿血清中的表达及临床意义

秦建品，陈 明，许 诣，沈文婷

(湖北文理学院附属医院/襄阳市中心医院儿科，湖北 襄阳 441021)

癫痫是一类由脑组织内神经元高度同步化异常放电引起的综合征，是儿科常见疾病之一，其发病机制复杂，临床以反复、短暂、发作性中枢神经系统功能紊乱为特征，患者多表现为意识丧失、四肢抽搐、精神及行为障碍等[1]。流行病学结果显示，癫痫在一般人群中的发病率为0.4%～0.7%左右，以少儿居多[2]。微小RNA(miRNA)是一类长度约18～25个核苷酸的内源性非编码RNA，通过与靶基因的3′端非翻译区匹配转录后进行调控，可抑制翻译或降解mRNA来阻止蛋白表达；miRNA的失调可能导致神经损伤和神经退行性疾病，包括癫痫[3]。早期研究发现，miR-219是一种脑特异性miRNA，通过调节CaMK2G/NMDA通路在抑制癫痫发作的过程中发挥关键作用[4]。有研究表明miR-219a-5p是钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin dependent protein kinase Ⅱ gamma，CaMK2G)的靶基因[5]，在神经元的发育中起重要作用；而癫痫的发作与神经元凋亡和脑损伤有关[6]，但其具体作用机制至今尚未阐明。基于此，本研究通过检测癫痫患儿血清中miR-219a-5p与CaMK2G的表达水平，探讨二者的关系及临床意义。

1资料和方法

1.1研究对象

选取2017年6月至2019年6月本院收治的46例癫痫患儿为研究组，均符合国际抗癫痫联盟于2016年制定的癫痫及癫痫综合征分类诊断新方案[7]。同期选取与研究组性别、年龄相对应的50例健康体检儿童为对照组，排除既往癫痫发病史或家族癫痫发病史、合并感染性疾病、脑炎、肿瘤、自身免疫性疾病患儿。本研究获得本院伦理委员会批准(NO.2017-0326)，入组儿童家属或监护人均知情同意。

1.2样本采集与检测

研究组患儿在癫痫发作时取外周血5mL，对照组儿童取清晨空腹静脉血5mL，3 000r/min离心15min，分别置于干净EP管中，贴好标签，-20℃条件下保存。采用荧光定量PCR技术对血清中miR-219a-5p、CaMK2G水平进行检测。使用Trizol试剂盒从血清中提取总RNA，利用NanoDropND-1000分光光度仪(NanoDrop Tech，美国)检测RNA浓度。使用PrimeScript RT反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，以上均严格按照说明书操作步骤执行。循环参数：95℃，预变性3min；90℃，变性5s；60℃，退火20s，共40个循环。miR-219a-5p以U6为内参，CaMK2G以GAPDH为内参。引物序列由生工生物工程公司合成(表1)。采用2-△△Ct法计算miR-219a-5p的相对表达量及CaMK2G水平。

表1 引物序列

1.3统计学方法

2结果

2.1两组患儿一般资料的比较

研究组和对照组患儿在年龄、性别、身高、体重方面的差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表2。

2.2两组患儿血清miR-219a-5p、CaMK2G表达水平比较

研究组患儿血清中miR-219a-5p水平明显高于对照组，CaMK2G水平明显低于对照组，差异均有统计学意义(t值分别是5.314、3.855，P<0.05)，见表3。

表2 两组患儿一般资料的比较

表3 研究组和对照组血清中miR-219a-5p、CaMK2G表达水平比较

2.3血清miR-219a-5p、CaMK2G水平对癫痫患儿的诊断价值

ROC分析结果显示，血清miR-219a-5p、CaMK2G诊断癫痫患儿的曲线下面积(area under the curve，AUC)分别为0.807(95%CI：0.714～0.881)、0.752(95%CI：0.653～0.834)，其灵敏度分别是69.57%、78.26%，特异度分别是80.00%、62.00%；血清miR-219a-5p、CaMK2G联合预测癫痫患儿的AUC为0.860(95%CI：0.774～0.922)，灵敏度和特异度分别为97.83%、60.00%，详见图1和表4。

图1 血清miR-219a-5p、CaMK2G水平断癫痫患儿的ROC曲线

表4 血清miR-219a-5p、CaMK2G水平对癫痫患儿的诊断价值

2.4癫痫患儿血清miR-219a-5p、CaMK2G水平的相关性

Pearson相关性分析显示(图2)，癫痫患儿血清miR-219a-5p与CaMK2G水平呈负相关关系(r=-0.424，P<0.05)。由miRTarBase可知miR-219a-5p靶向CaMK2G表达的基因序列有3段，如图3所示。

图2 癫痫患儿血清miR-219a-5p、CaMK2G表达的相关性

图3 miR-219a-5p靶向CaMK2G表达的基因序列

3讨论

3.1探讨癫痫发生相关指标的重要性

癫痫是由脑组织神经元异常放电引起脑功能异常的神经系统疾病，其发病具有不可预知性，反复性发作可导致脑功能损伤；若未得到及时治疗，可造成患儿智力障碍，不仅影响身心健康，还对今后的学习、生活造成严重损害。我国癫痫相关的流行病学研究显示，华东和西南地区的癫痫患病率在0.5%左右，患病人数高达900万，首次发病多发生于儿童、青少年时期，男性多于女性，有显著的遗传倾向，基因突变和蛋白质异常修饰在癫痫的发病中占主要原因[8]。

3.2 miRNA在癫痫发病机制中的作用

随着生物基因技术的发展，人们发现miRNA广泛存在于生物体内，能够结合数百种转录产物，参与生命过程中细胞的增殖、分化、发育及凋亡[9]。有研究表明，miRNA参与调控少突胶质细胞的增殖、分化过程，通过结合靶mRNA抑制蛋白质合成或导致mRNA降解来调控基因表达。研究发现，临床上可利用侧脑室注射miRNAs激动剂治疗脑损伤[10]。廖芸茜等人将出生2天的Sprague-Dawley大鼠用脂多糖模拟早产儿脑白质损伤，通过侧脑室注射miR-219激动剂提高miR-219在大鼠脑组织中的表达，结果发现可有效抑制SOX6蛋白表达，提高成熟少突胶质细胞标志物MBP表达，从而改善全身炎症导致的新生大鼠少突胶质细胞成熟障碍[11]。

3.3血清miR-219a-5p和CaMK2G水平在癫痫患儿中的表达及诊断价值

少突胶质细胞活化、增生可使血脑屏障的完整性和细胞内微环境电解质的平衡遭到破坏，导致神经元过度异常放电，从而引起癫痫的发生、发展[12]。miR-219是少突胶质细胞特有的miRNA，是促进少突胶质细胞分化成熟的必需物质，能改善由总miRNA缺失导致的少突胶质细胞分化发育缺陷。最新研究发现，miR-219在癫痫患者杏仁核中低表达，可能在癫痫患者的兴奋性神经传递中发挥调控作用，为耐药癫痫的miRNA生物学开辟了新的途径[13]。Wang等人将miR-219模拟物转染大鼠海马神经元，观察miR-219对谷氨酸诱导的海马神经元神经毒性的保护作用，荧光素酶报告基因确认CaMK2G是miR-219的靶基因，经谷氨酸刺激后miR-219表达下降、CaMK2G表达上升，说明miR-219通过负调控CaMK2G表达而减轻谷氨酸诱导的神经源毒性[14]。CAMK2G表达降低可能严重损害神经元的迁移和成熟[15]。有报道称，可在小鼠海马神经元损伤模型中检测到miR-219a-5p差异性表达[16]。本研究结果显示，与对照组相比，癫痫患儿血清中miR-219a-5p表达上调而CaMKII2G表达下调；Pearson相关分析显示癫痫患儿血清miR-219a-5p与CaMK2G水平呈负相关，上述结果均提示miR-219a-5p可能靶向负调控CaMK2G表达，与癫痫的发病、发展有关。ROC分析显示，血清miR-219a-5p和CaMK2G对癫痫患儿均有一定的预测价值，且二者联合应用时预测价值最大。

综上所述，癫痫患儿血清miR-219a-5p表达上调，CaMK2G表达下调，miR-219a-5p可能通过靶向负调控CaMK2G表达参与癫痫的发生发展，但具体的作用机制有待进一步研究。