浓香型白酒糟醅细菌多样性与窖龄关联度的研究

胡 斌，罗明有，王 松，周瑞平，刘 江，付雨晴，唐代云，刘 超

（1.四川省宜宾市叙府酒业股份有限公司，四川宜宾 644600；2.宜宾学院固态发酵资源利用四川省重点实验室，四川宜宾 644600）

生产经验和研究均表明通常情况下窖龄越长的窖池，原酒的产质量也越好。糟醅作为直接承载酿酒微生物生长繁殖的载体，对浓香型白酒的窖内发酵有着非常重要的影响，现有绝大部分研究都是围绕窖龄与窖泥微生物多样性的关系来进行的，对窖龄与其窖内糟醅微生物多样性之间关联度的研究不足。本次研究以宜宾产区某知名酒企3 口不同窖龄窖池发酵前后的糟醅为对象，深入探究不同窖龄窖池对发酵糟醅影响的差异和共性，为指导白酒生产提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

20 年窖龄窖池混合入窖及出窖糟醅，25 年份窖池混合入窖及出窖糟醅，36年份窖池混合入窖及出窖糟醅，储存期6 个月以上的偏高温大曲（粉碎后）。

1.2 试验方法

1.2.1 糟醅样品的处理及采集

分别选取20 年、25 年、36 年年份窖池中具有代表性且产质量稳定的窖池各1 口进行跟踪采样，选取的20 年份、25 年份、36 年份窖池窖号分别为5-3-11、3-3-13、2-2-8，按照宜宾产区五粮浓香型白酒生产工艺进行发酵，所有工艺参数无人为差异性调整（基本保持一致），共计取样三个轮次，第一轮次为2020 年1 月份，分别对3 口实验窖池入窖糟醅进行采样，采样分上中下3 层，每层使用五点取样法取样约1 kg 后均匀混合，取其中一部分进行理化检测，另外一部分放置于-80 ℃超低温冰箱保存待用；2020 年4 月份分别对该3 口实验窖池按相同的采样和封存方法对出窖糟醅及入窖糟醅进行采样封存并检测，此后依次为2020 年9 月（热季放假45 d）对出窖及入窖糟醅进行采样封存检测，2020年12 月对第三轮次的出窖糟醅进行采样封存。按窖龄分别将封存的3 个轮次的入窖及出窖糟醅混合均匀。

1.2.2 样品编号

20年窖龄窖池混合入窖、出窖糟醅实验样品编号分别为A1、A2，25 年窖龄窖池混合入窖、出窖糟醅实验样品编号分别为B1、B2，36年窖龄窖池混合入窖、出窖糟醅实验样品编号分别为C1、C2。

1.2.3 实验样品检测

高通量测序交由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。糟醅酸、水、淀等理化指标参照文献的方法进行检测并取平均值分析。无线温度传感器对窖内上中下三层发酵温度进行监测并取平均值。

2 结果和分析

2.1 实验窖池发酵状况概述

不同窖龄窖池发酵温度及理化指标变化（表1）趋势基本一致，该变化符合宜宾产区五粮浓香型白酒生产规律，判断该三口实验窖池均发酵正常（备注：由于入窖糟醅经过高温蒸馏，部分还原糖已经转化成焦糖等物质，不具备参考意义，因此在测定的时候不在对该指标进行测定）。

表1 糟醅在不同年份窖池发酵前后理化参数对比

2.2 不同样品OTUs、多样性指数

将所有样本序列按照序列间的距离进行聚类，在97 %的相似水平下进行生物信息统计分析，在OTU 聚类结果的基础上，选择丰度最高的序列作为OTU 的代表性序列，共得到入窖细菌OTUs 数量1208 个，共有OTUs 数量257 个（图1）；出窖细菌OTUs 数量1049 个，共有OTUs 数量32 个（图2）。对比试验糟醅样品发酵前后Alpha 多样性指数显示，3 个试验糟醅在发酵后细菌物种多样性均大幅下降、物种丰度大幅上升，共有细菌OTUs 数量减少，结合生产实际分析，在发酵过程中缺氧、酸性的环境淘汰了大部分好氧型细菌，发酵过程中厌氧或兼性厌氧型细菌消耗窖内淀粉等营养物质大量繁殖，使得物种丰度大幅上升。不同窖龄出窖糟醅中共有的32 个细菌OTUs 可能为生产过程中的关键细菌，可从中选取具有代表性的功能性细菌进行研究。

图1 浓香型入窖糟醅细菌韦恩图

图2 浓香型出窖糟醅细菌韦恩图

2.3 Alpha多样性指数计算（表2）

Coverage 指数为各样品文库的覆盖率，数值越高，样本中序列没有被测出的概率越低。由表2 可知，所有样品Coverage 指数均大于0.99，故本次测序结果可以代表样本的真实情况。

2.4 Alpha多样性指数分析

由表2 可以看出，不同窖龄窖池内糟醅发酵后，细菌物种多样性均大幅减少，物种丰度均大幅增加，物种多样性及物种丰度的整体变化趋势基本一致，窖龄与糟醅发酵过程中细菌整体变化趋势无明显关联。

表2 糟醅细菌的序列数、OTU数及Alpha多样性指数

对比出窖糟醅细菌多样性指数发现，36年窖池发酵糟醅物种多样性最低，物种丰度最高，窖龄与出窖糟醅细菌物种多样性成反比、与细菌物种丰度成正比。结合企业生产实际分析，窖龄越长的窖池在细菌组成结构上更优，能够筛选掉更多与白酒产质量无关的细菌，从而扩大有益细菌的生存空间，进一步提高产质量。

2.5 基于属水平的细菌群落分析

选取在属水平上相对丰度前十的细菌属制作百分比堆积柱形图，见图3，可以直观地看到样本优势菌种的分类及占比情况，有利于发现浓香型出窖糟醅在属水平上菌种组成的差异，为车间技改提供一定的理论基础。

由图3 可以看出，A2、B2、C2 中乳杆菌属占比为81.45 %、95.84 %、97.41 %，均占据绝对优势，随着窖池年份的增加，乳杆菌属的占比增加。韩兴林等的研究表明，在浓香型白酒发酵后期主要产乳酸和乳酸乙酯，在实际生产过程中，可以通过人为调整窖期的方式达到控制白酒中乳酸、乳酸乙酯含量的目的，进一步加强人为干预对白酒生产的影响。3 个不同年份窖池出窖糟醅中，除乳杆菌属外含量最多且共有的细菌属为假单胞菌属，可对其分离纯化后进行功能性分析。

图3 浓香型出窖糟醅细菌属水平结构分析

由图3 可以看出，在20 年窖池糟醅中，检出了多种25 年及36 年窖池出窖糟醅中未检出的细菌菌属；25 年窖池出窖糟醅中，检出多种36 年窖池出窖糟醅未检出的细菌菌属；36年窖池出窖糟醅中检出的细菌菌属的种类数最少。结果显示随着窖龄增长，窖内发窖糟醅细菌组成结构更优，与Alpha 多样性指数分析结论一致，在实际生产过程中，可根据出窖糟醅中检出的细菌菌属种类数在一定程度上判断窖池的老熟程度。

3 结论

3.1 不同窖龄窖池糟醅发酵后，细菌物种多样性大幅下降、物种丰度大幅上升，共有细菌OTUs 数量减少，物种多样性及物种丰度的整体变化趋势基本一致，窖龄与其糟醅发酵过程中细菌整体变化趋势无明显关联。

3.2 窖池窖龄与出窖糟醅细菌物种多样性成反比、细菌物种丰度成正比，窖龄越长的窖池在细菌组成结构上更优，能够筛选掉更多与白酒产质量无关的细菌，从而扩大有益细菌的生存空间，进一步提高产质量。

3.3 在不同窖龄的出窖糟醅中，乳杆菌属均占据绝对优势，随着窖池年份的增加，乳杆菌属的占比与窖龄成正相关增加。在实际生产过程中，可以通过人为调整窖期的方式以达到控制白酒中乳酸、乳酸乙酯含量的目的，进一步加强人为干预对白酒生产的影响。

3.4 在不同年份窖池出窖糟醅中，除乳杆菌属外含量最多且共有的细菌属为假单胞菌属。

3.5 随着窖龄增长，窖内发窖糟醅细菌组成结构更优，在实际生产过程中，可以根据出窖糟醅中检出的细菌菌属种类数在一定程度上判断窖池的老熟程度，为技术指导生产实践提供一定的理论依据。