基于高通量测序技术解析皖北地区浓香型大曲的真菌群落结构

程 伟，陈雪峰，陈兴杰，周 端，杨金玉，薛锡佳，潘天全

（1.陕西科技大学食品与生物工程学院，陕西西安 710021；2.安徽金种子酒业股份有限公司，安徽阜阳 236023；3.陕西农产品加工技术研究院，陕西西安 710021）

中国白酒以粮谷为主要原料，经蒸煮糊化、摊晾加曲、固态发酵、蒸馏分类、存储勾调等工序制备而成，酒曲作为糖化发酵剂，对白酒的品质具有重要影响。微生物类群是决定大曲品质的关键因素，大曲培养过程中富集的环境微生物是白酒酿造微生物的重要来源。大曲微生物菌群中的真菌在酿酒过程的产酒、产酶和产香等方面均具有重要作用。大曲中的霉菌对酒曲发酵过程中的糖化力、酯化力等起到重要影响，霉菌的生长利用曲料中的发酵底物代谢产生某些影响白酒风味的呈香物质。大曲菌群在白酒发酵过程中表现出特异性和周期性的演替特征。因此，对大曲真菌菌群的研究有利于阐明白酒发酵生香的机理，对明确不同产地的白酒风格特点具有重要意义。中国白酒以流域为纽带形成了不同的聚集产区，长江上游产区和黄淮流域产区较为著名。皖北地区属于中国白酒黄淮河流域产区，该产区以浓香型白酒为主，口感风格偏向“绵顺柔和”，主要白酒品牌有古井贡酒、金种子酒、文王贡酒等。

传统的大曲微生物研究主要采用分离培养等方法。高通量测序技术的数据产出通量高，具有分析全面、灵敏、快速等特点，能够更加客观地反映样品中微生物群落结构的真实性。近年来，采用高通量测序技术对酒曲微生物群落结构进行了较多研究，张会敏通过PCA-TA 克隆测序方法对古井贡酒高温大曲和中高温大曲中的微生物多样性进行研究，确定了两种大曲中的优势细菌菌种；施思等采用高通量测序技术研究大曲在贮藏过程中的微生物多样性变化，结果表明，大曲贮存过程中的真菌群落结构不断变化，毕赤酵母属、根霉菌属及横梗霉属最终成为大曲中的优势菌群。对大曲微生物群落特征及差异的研究，有利于加深对大曲和白酒发酵机理的理解，进而提高大曲的质量调控水平。

当前，关于大曲微生物群落结构的研究逐渐增多，但是针对皖北地区浓香型大曲真菌群落结构的研究较少，尤其是关于曲皮和曲心真菌群落结构的分析及其差异物种的比较还鲜有报道。本实验通过高通量测序分析皖北地区3 家不同酒企浓香型大曲的真菌群落结构，并进行T-test 以比较组间差异物种，该研究为明确皖北地区浓香型大曲的真菌群落结构提供依据，对大曲的微生物组信息扩充具有参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

大曲样品：均为培养成熟刚入库贮存的成品曲，分别取自安徽阜阳（FY）、安徽亳州（BZ）和安徽临泉（LQ）等皖北地区3 家典型的浓香型白酒酿造生产企业。

试剂及耗材：氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠（分析纯），天津市永大化学试剂有限公司；饱和酚、十二烷基硫酸钠（SDS）、乙二胺四乙酸（EDTA）-Na2、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）（分析纯），北京索莱宝科技有限公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris）（分析纯），美国Sigma-Aldrich 公司；AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒，美国qiagen公司。

仪器设备：超低温冰箱、TGL-20M 高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Gene-Amp@9700 型聚合酶链式反应PCPO 仪，美国ABI公司；MX.S型混匀仪，美国SCILOGEX公司；QuantiFluor型-ST荧光定量系统，美国Promega公司。

1.2 实验方法

1.2.1 取样方法

取皖北地区3 家典型浓香型白酒酿造生产企业的大曲，分别取大曲表层的1～2 cm 作为曲皮样品（样品组“-S”，分别命名为FYS、BZS、LQS）、取曲块中心2～3 cm的区域作为曲心样品（样品组“-I”，分别命名为FYI、BZI、LQI），随机设置3 个平行样品。将3 个平行样品在无菌条件下等量混合后粉碎，保存于无菌袋中，置于-80 ℃冰箱以备大曲微生物总DNA的提取。

1.2.2 大曲真菌群落的结构分析

大曲微生物总DNA 的提取：利用CTAB 法进行改良以提取大曲微生物的总DNA，向离心管中加入200 μL无菌双蒸水沉淀溶解总DNA，置于-20 ℃备用，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的纯度和浓度。

PCR 的扩增与定量：以稀释后的基因组DNA为模板，选择测序区域后使用带Barcode 的特异引物（Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer:New England Biolabs）和高效高保真酶进行PCR扩增，确保扩增效率和准确性。引物对应区域：ITS1区引物(ITS5-1737F和ITS2-2043R)。

PCR 产物的纯化：使用琼脂糖凝胶(浓度为2%)对PCR产物进行电泳检测，对检测合格的PCR产物进行磁珠纯化。采用酶标定量并根据PCR 产物浓度进行等量混样，进行电泳检测PCR 产物，回收目的条带产物。

构建文库与上机测试：采用TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建库试剂盒构建文库，经过Qubit 和Q-PCR 定量，文库合格后使用NovaSeq6000 进行上机测序。建库与测序等实验部分在苏州帕诺米克生物科技有限公司完成。

1.2.3 测序数据统计与绘图

高通量测序完成后，进行数据分析和序列优化。根据序列的相似性，将序列相似性大于及等于97%的分归为同一OTU，将所有序列与Silva 库（版本SILVA_138.1）进行比对得到序列的分类学信息。采用R 语言和AI 作图工具绘制测序数据的稀释曲线和堆积柱状图等。

2 结果与分析

2.1 大曲真菌多样性分析

2.1.1 序列统计、有效性与Alpha多样性分析

本实验对皖北地区3 个不同产地浓香型大曲的曲皮与曲心分别提取DNA 进行测序，设计引物扩增序列最大长度为350 bp，分别得到74391～91030 条真菌有效序列，测序长度主要分布在225～269 bp，与设计引物扩增长度接近，表明本实验的测序结果较合理。对测序结果在97%相似度的OTU 水平进行Chao 指数计算，聚类分析共产生1696 个OTU 分类。由表1 可以看出，各样品Coverage ≥0.999，表明本实验的测序结果可以较为真实地反映各样品中的真菌多样性，测序结果的有效性较高。

通过单个样品的微生物多样性分析（Alpha 多样性），可以反映样品中微生物群落的丰度和多样性，包括Shannon 指数、ACE 指数、Chaol 指数和Simpson 指数等4 个多样性指数。通过构建稀释曲线和Shannon 曲线，可以判断取样的合理性和测序量及测序深度的有效性。Shannon 和Simpson 指数可以反映样品中微生物的物种多样性，由表1 可知，不同产区浓香型大曲曲皮与曲心中的真菌多样性指数均存在明显差异。Shannon指数常用来评价微生物群落的物种多样性，对样品中的微生物群落物种丰富度更为敏感，指数越大代表样品中的微生物多样性越高，由表1 可知，BZS 的Shannon 指数最大，表明BZS 中的真菌多样性最高。Chao1 指数和Simpson 指数常用来表征微生物群落的物种丰富度，Chao1 指数还常用来估计物种总数，指数越大代表样品中的微生物群落物种丰富度越高，由表1 可知，BZS 的Chao1 指数和Simpson 指数最高，表明BZS中的真菌群落物种丰富度最高。

表1 不同大曲样品真菌Alpha多样性指数

2.1.2 OTU分布的Venn分析

亳州（BZ）与阜阳（FY）属于皖北地区相邻的地级市，临泉县（LQ）地处阜阳市的南部，隶属于阜阳市管辖，三地的地理位置相对临近。对皖北不同产地浓香型大曲曲皮与曲心中获取的真菌OTU 进行分类统计，对不同样品之间相对共有及独有的OTU 数进行叠加，可进一步直观地比较OTU 数目组成相似性及重叠情况。由1（a）可知，不同曲皮样品的共有OTU 为99 个，占曲皮总OTU 的10.70%，其中，BZS 的OTU 数最大为388 个，占曲皮总OTU的41.95%，可知BZS 的真菌多样性较高。由1（b）可知，不同曲心样品的共有OTU 为63个，占曲心总OTU 的8.17%，其中，FYI 的OTU 数最大为264 个，占曲心总OTU 的34.20 %，可知FYI 的真菌多样性较高。由图1（c）可知，BZS 的OTU 数为388 个，明显高于其他样品；整体而言曲皮的OTU 数均高于曲心。

图1 不同大曲样品中真菌OTU的差异性对比

通常情况下，如果序列之间的相似性高于97%，就可以把它定义为一个OTU，每个OTU 对应一个不同的16S rRNA 序列，即每个OTU 对应一个不同的微生物种。通过OTU 分析，可以知道样品中的微生物多样性和不同微生物的丰度。图2 表示不同大曲样品曲皮与曲心中的核心真菌共有OTU（Venn 图），重叠部分的数字表示不同样品的共有真菌OTU 数，非重叠部分的数字表示各样品特有真菌OTU数。由图2可知，不同大曲样品曲皮和曲心中的共有核心真菌OTU 数为51 个，占曲皮和曲心核心真菌总OTU 数的6.74 %；BZS 的核心真菌OTU 数为185 个，占曲皮和曲心核心真菌总OTU 数的24.44%，占比在6 个不同样品中最高，表明BZS的核心真菌菌群的多样性最高。

图2 不同大曲样品曲皮与曲心中核心真菌共有OTU（Venn图）

2.2 大曲真菌群落结构分析

2.2.1 大曲真菌门的分类

将得到的各类OTU 代表序列与Unite 真菌数据库进行比对，得到每个OTU 在不同分类水平的物种分类信息。如图3（a）不同样品真菌门水平的相对丰度柱状图所示，BZS、LQS、BZI 和FYI 中子囊菌门（Ascomycota）均为优势菌门，占比分别为82.45 %、90.95 %、94.77 %和95.54 %；FYS 和LQI中的子囊菌门（Ascomycota）和毛霉菌门（Mucoromycota）均为优势菌门，FYS 中的子囊菌门（Ascomycota）和毛霉菌门（Mucoromycota）占比分别为34.05 %和64.00 %，LQI 中的子囊菌门（Ascomycota）和毛霉菌门（Mucoromycota）占比分别为53.31 %和44.48%。由图3（b）可知，FYI 中的子囊菌门（Ascomycota）为绝对优势菌门，占比为95.54 %。综上可知，FYS 和LQI 中的优势菌门明显区别于其他样品，原因还有待于深入研究。

由图3（a）可知，BZS中的优势菌门为子囊菌门（Ascomycota，82.45 %）、毛霉亚门（Mucoromycota，5.46 %）和子菌门（Basidiomycota，1.39 %），BZI 中的优势菌门为子囊菌门（Ascomycota，94.77 %）和毛霉亚门（Mucoromycota，7.22 %），以上优势菌门的占比均在1.00 %以上。张会敏等利用ITS rDNA 克隆文库法分析古井贡酒大曲（亳州地区的浓香型大曲）中真核微生物的群落结构，结果表明，古井贡酒浓香型大曲中的真菌组成可归为子囊菌门（Ascomycota）、毛霉亚门（Mucoromycota）、担子菌门（Basidiomycota）等3 个优势菌门，该研究结果与本实验的结果相似。

由图3（a）可知，在不同的曲皮样品中，FYS 中的子囊菌门（Ascomycota）占比为34.05 %，明显低于其他2 个曲皮样品；FYS 中的毛霉菌门（Mucoromycota）占比为64.00 %，明显高于其他2 个曲皮样品。在不同的曲心样品中，LQI 中的子囊菌门（Ascomycota）占比为63.3%，明显低于其他2个曲心样品；LQI 中的毛霉菌门（Mucoromycota）占比为44.48%，明显高于其他2 个曲心样品。综上可知，FYS 和LQI 中的优势菌门区别于其他样品，皖北不同产地大曲的曲皮与曲心样品中真菌群落丰度存在一定的差异，这可能会导致不同大曲理化指标的差异，主要原因可能在于制曲温度的差异。

图3 不同大曲样品中真菌门水平的相对丰度柱状图

2.2.2 大曲真菌属的分类

如图4（a）不同样品组真菌属水平的相对丰度柱状图所示，曲皮样品组中总体丰度较高的菌属有布氏白粉菌属（BZS，，57.13 %）、根霉属（FYS，，62.77 %）和子囊菌属（LQS，，54.18%），曲心样品组中总体丰度较高的菌属有踝节菌属（BZI，，44.12%）、嗜热子囊属（FYI，，44.89 %）和布氏白粉菌属（LQI，，36.99 %）。综上可知，皖北地区不同酒企大曲样品的曲皮和曲心中的优势菌属均不相同。

图4 不同大曲样品中真菌属水平的相对丰度柱状图

制曲培养过程中，曲心的温度普遍高于曲皮的温度；不同培曲温度对大曲微生物群落结构、酶活及挥发性化合物等均产生重要影响；因此，可能导致曲心的嗜热菌属结构及其丰度高于曲皮，也可能导致曲皮中的根霉或曲霉等适宜温度相对不高的菌属结构及其丰度高于曲心。由图4（a）可知，嗜热子囊属（）在BZI、FYI 和LQI 等曲心样品中的占比分别为3.47%、44.89%和2.88%；嗜热子囊属（）在LQS 中的占比为22.55 %，明显高于其他2 个曲皮样品（FYS、0.14 %；BZS、0.57 %）。根霉属（）在BZS、FYS 和LQS 等曲皮样品中的占比分别为2.01 %、62.77 %和7.01 %；然而，根霉属（）在LQI中的占比为35.93 %，明显高于其他2 个曲心样品（FYI、1.23 %；BZI、2.95 %），根霉属（）可以分泌多种水解酶，有利于促进原料淀粉的分解利用。同属于皖北地区，地理位置接近，气候差异不明显，不同曲心与曲皮样品中嗜热子囊属（）和根霉属（）的差异，可能是由于不同酒企制曲工艺的差异所导致，尤其是培曲温度及顶温的差异。

如图4（b）FY 样品真菌属水平的相对丰度柱状图所示，FYS 的优势菌属为根霉属（，62.77 %），FYI 的优势均属为嗜热子囊属（，44.89%）。结合图4（a）可知，酵母菌属（）在BZS 和LQI 中的占比分别为2.01 %和1.83 %，在其他3 个样品中的占比均低于1.00 %；酵母菌属（）在FYS 中的占比达到17.10 %，明显高于其他样品，这可能是由于制曲工艺的差异所造成的，尤其是添加酵母制品或其他微生物制品用于强化制曲。

2.3 大曲真菌门水平的组间差异

利用Alpha 多样性指数组间的差异分析，能够判别出不同组别间的整体群落结构是否有显著性的不同，这种不同究竟是由哪些差异物种导致的，就需要组间差异物种分析。为了找出组间具有显著差异的物种，可以通过T-test、Metastat 和LEfSe等方法寻找标记性质的物种，即biomarker 从不同层级的物种丰度出发，通过常规的T-test 可以得到差异物种。为寻找真菌门（Phylum）分类水平下不同分组间的差异物种，进行曲皮与曲心样品组间的T-test检验，找出差异显著（p值＜0.05）的物种。

如图5 所示的大曲样品组中真菌门水平的组间T-test 可知，曲皮和曲心样品组间丰度差异显著的物种为子囊菌门（Ascomycota）和毛霉菌门（Mucoromycota）；子囊菌门（Ascomycota）在曲皮和曲心样品组的丰度分别为52.52%和87.41%；毛霉菌门（Mucoromycota）在曲皮和曲心样品组的丰度分别为41.60%和9.21%。由图5（b）所示的组间差异置信度展示可知，曲心样品组差异物种的p值为0.028（p 值＜0.05），曲心样品组均值差的95 %置信区间下限为-0.65，区间上限为-0.05；曲皮样品组差异物种的p 值为0.048（p 值＜0.05），曲皮样品组均值差的95%置信区间下限为0.01，区间上限为0.64。综上可知，基于门水平的组间T-test 具有可信度，大曲样品组间的差异物种为子囊菌门（Ascomycota）和毛霉菌门（Mucoromycota）。

图5 不同大曲样品组真菌门水平的组间T-test

图5 说明：a 图中每个条形分别表示在分组间丰度差异显著的物种在每个组中的均值；b 图中每个圈的最左端点表示均值差的95 %置信区间下限，圆圈的最右端点表示均值差95 %置信区间上限，圆圈的圆心代表的是均值的差，圆圈颜色所代表的组为均值高的组，展示结果的最右端是对应差异物种的组间显著性检验p值。

3 结论

本实验通过高通量测序比较了皖北地区3 家典型酒企浓香型大曲的真菌群落结构，得到的结论主要有：（1）不同曲样的曲皮共有真菌OTU 为43个，曲心共有真菌OTU 为47 个，曲皮与曲心共有真菌OTU为51个；（2）曲皮样品组中丰度较高的有布氏白粉菌属（BZS，，57.13 %）、根霉属（FYS，，62.77 %）和子囊菌属（LQS，，54.18%），曲心样品组中丰度较高的有踝节菌属（BZI，，44.12 %）、嗜热子囊属（FYI，，44.89 %）和布氏白粉菌属（LQI，，36.99 %）；（3）基于门水平的组间T-test 表明，曲皮和曲心分组间的差异物种为子囊菌门（Ascomycota）和毛霉菌门（Mucoromycota）。

大曲微生物多样性研究对探究不同制曲工艺的微生物差异、解析相关功能菌株具有重要意义；功能菌株的筛选、纯化及强化应用，对提高白酒品质、原料利用率和特征风味成分含量等具有重要影响，有利于为微生物菌群的强化应用提供思路。综上可知，皖北地区3 家典型酒企浓香型大曲的真菌群落结构各具特点，差异性可能是由于不同区域环境微生物、制曲工艺等造成。该研究为明确皖北地区浓香型大曲的真菌群落结构提供依据，对大曲微生物组的信息扩充具有一定参考价值。