FSCN1蛋白在胃癌组织中的表达及临床意义

于嫔，朱蔚远，彭文斌，范月娥，王跃平

胃癌是最为常见的消化道癌症，流行病学研究发现，2018年共有782 685例胃癌患者死亡，占所有癌症死亡人数的8.2%，是全球癌症死亡的第三大原因[1-3]，严重威胁患者身心健康[4]。我国胃癌早期诊断率不到10%，远低于发达国家。因此，寻找早期指示胃癌发展的生物标志物对胃癌早期诊断及时治疗具有重要临床意义[5-6]。研究发现，肌动蛋白细胞骨架网络在肿瘤细胞迁移、侵袭中起重要作用，成束蛋白1(Fascin1，FSCN1)是一种与肌动蛋白结合的细胞骨架蛋白，参与内皮细胞纤足形成，促进内皮细胞转移[7-8]。已有研究发现，FSCN1在胃癌组织中表达上调，受Notch1信号通路调控参与肿瘤的侵袭与转移过程[9-10]。越来越多的研究认为，细胞骨架改变对肿瘤的发生发展起促进作用[11]。本研究通过检测胃癌患者肿瘤组织中FSCN1蛋白的表达水平，探究其与胃癌发展及预后的关系，分析其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年1月至2015年12月我院手术切除的82例胃癌患者，术中取得胃癌组织标本82例及癌旁正常胃黏膜组织标本63例，所有患者组织标本均经病理检查证实为胃癌。所有患者均为首次治疗，术前均未行放疗、化疗或其他抗肿瘤治疗，临床病理资料及随访资料完整。所有患者均自愿签署知情同意书，本研究获得本院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 数据库分析 GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)是一个由北京大学开发的数据库，是基于癌症基因组图谱(the cancer genome atlas，TCGA)的数据分析及可视化的网站，可实现相关癌症基因的生物标志物鉴定、表达图谱分析、生存预后分析等。本研究基于TCGA数据库，对FSCN1 mRNA在胃癌组织及正常胃黏膜组织中表达差异进行比较。

1.2.2 免疫组化法检测胃癌组织及癌旁正常胃黏膜组织中FSCN1蛋白表达 将石蜡组织标本以4 μm连续切片，常规脱蜡、水化处理，采取免疫组化EnVision两步染色法检测FSCN1蛋白表达情况，操作均由检验科同一名经验丰富的医师严格按照试剂盒说明书步骤进行。一抗采用兔抗人FSCN1抗体(购自美国Sigma公司)，即用型二抗购自北京索莱宝科技有限公司。二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染，脱水、透明、封片后观察。用已知阳性切片标本为阳性对照，阴性对照用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗制成。

结果判定标准：①按染色强度评分：无染色为0分，浅黄色为1分，黄色或黄棕色为2分，棕褐色为3分；②按阳性细胞所占比例评分：无阳性细胞记0分，阳性细胞所占比例<25%记1分，26%～50%记2分，51%～75%记3分，>75%记4分。两种评分方法得分的乘积为最终结果，以最终结果>2分定义为表达阳性(+)，≤2分定义为表达阴性(-)；同时定义最终结果≥3分为高表达，<3分为低表达。

1.2.3 随访 胃癌患者术后均以电话或门诊方式进行随访，随访起始日期为术后第一个月，截止日期为2020年12月或患者死亡。第1～2年每1～3个月随访一次，第3～4年每6个月随访一次，之后每年随访一次。记录胃癌患者预后情况，分析FSCN1蛋白表达水平与患者生存时间的关系。

1.2.4 FSCN1共表达基因互作分析 基于Coexpedia数据库(https://www.coexpedia.org/)分析FSCN1共表达基因互作关系，选取共表达的对数似然分数(Log likelihood score，LLS)，基因对按照Pearson相关系数的降序排列，计算每个bin的LLS。

1.2.5 FSCN1共表达基因的富集分析 使用R3.6.3软件中的clusterProfiler包进行共表达基因的富集分析，并利用Enrichr(http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr)在线分析工具进行GO功能注释和KEGG通路分析，分析FSCN1参与的生物学功能、信号通路等内容。

1.2.6 FSCN1表达与胃癌患者免疫细胞浸润的相关性分析 利用TCGA数据库下载数据，分析胃癌患者FSCN1表达与免疫细胞浸润之间的关系。利用R3.6.3软件中的GSVA包绘图，并以ssGSEA算法评估肿瘤细胞免疫浸润程度。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 FSCN1 mRNA在胃癌组织及正常胃黏膜组织中的表达水平

利用TCGA数据库比较408例胃癌组织和211例正常胃黏膜组织中FSCN1 mRNA的表达情况，结果显示FSCN1 mRNA胃癌组织中表达显著上调(P<0.05)，见图1。

图1 FSCN1 mRNA在胃癌组织及正常胃黏膜组织中的表达水平

2.2 免疫组化结果分析

免疫组化结果显示，FSCN1主要定位于细胞质，见图2。FSCN1蛋白在胃癌组织中的阳性表达率为60.98%(50/82)，明显高于正常胃黏膜中的19.05%(12/63)(P<0.05)，见表1。

图2 免疫组化结果(SP，×400)

表1 FSCN1蛋白在胃癌组织和正常胃黏膜组织中的阳性表达情况 n(%)

2.3 FSCN1蛋白表达水平与胃癌患者临床病理参数之间的关系

结果显示，FSCN1蛋白表达水平与胃癌患者年龄、性别、肿瘤位置无关(P>0.05)，与患者TNM分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移有关(P<0.05)，见表2。

表2 FSCN1蛋白表达水平与胃癌患者临床病理参数之间的关系 [n(%)]

2.4 生存分析

图3 FSCN1蛋白表达水平与胃癌患者生存时间的关系

2.5 影响胃癌患者预后的多因素Cox回归分析

多因素Cox回归分析结果显示，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、分化程度低、淋巴结转移、FSCN1蛋白高表达是影响胃癌患者预后的独立危险因素(P<0.05)，见表3。

表3 影响胃癌患者预后的多因素Cox回归分析

2.6 FSCN1共表达基因互作分析

本研究共分析FSCN1与303个基因的互作关系，根据LLS评分分析，相关性较强的前10个基因分别为APOE、ZYX、HOMER3、AXL、RBM42、ARHGDIA、ITGA3、PMAIP1、COL4A1、TP53，见表4。

表4 FSCN1共表达基因分析

2.7 FSCN1共表达基因的富集分析

FSCN1共表达基因主要参与细胞外基质组织、白细胞迁移、血小板活化、白细胞增殖、淋巴细胞增殖等生物学过程，富集到的主要通路包括黏着斑、阿米巴病、ECM-受体相互作用、PI3K-Akt信号通路、Hippo信号通路、病毒性心肌炎、细胞间黏附分子等信号通路。见图4。

图4 FSCN1共表达基因通路的富集分析

2.8 FSCN1表达与胃癌患者免疫细胞浸润的相关性

Spearman相关性分析显示，FSCN1表达与NK细胞、Tem细胞、浸润性树突状细胞(iDC)、巨噬细胞(Macrophages)、树突状细胞(DC)、Th1细胞、肥大细胞(Mast cells)、浆细胞样树突状细胞(pDC)、Tgd细胞、中性粒细胞(Neutrophils)、NK CD56dim细胞、滤泡辅助性T细胞(TFH)均呈正相关(r=0.408、0.259、0.230、0.222、0.195、0.174、0.171、0.167、0.156、0.142、0.139、0.129，P均<0.05)，与调节性T细胞(TReg)、中央记忆型T细胞(Tcm)、NK CD56bright细胞、嗜酸性粒细胞(Eosinophils)、B细胞、CD8 T细胞、自体树突状细胞(aDC)、细胞毒性细胞(Cytotoxic cells)、T细胞、Th2细胞均无明显相关性(r=0.099、0.095、0.080、0.060、0.054、0.049、0.043、0.037、-0.022、-0.022，P均>0.05)；与辅助性T细胞(T helper cells)、Th17细胞均呈负相关(r=-0.145、-0.188，P均<0.05)。见图5。

图5 FSCN1表达与胃癌患者免疫细胞浸润的相关性

3 讨论

FSCN1是一种55KD的单链肌动蛋白丝结合蛋白，与肿瘤活动进展和肿瘤细胞活动性有关，可调节细胞表面的丝状伪足、片状伪足和微穗状突起的形成，通过典型的Smad依赖通路促进细胞迁移、运动[12-13]。已有研究发现，FSCN1在多种恶性肿瘤如结直肠癌[14]、前列腺癌[15]、肾细胞癌[16]中表达上调，参与肿瘤进展，并与患者预后不良有关[17]。Wang等[18]研究报道称，FSCN1在胃癌细胞系及胃癌组织中的表达量高于正常细胞及正常胃黏膜组织，且随细胞分化程度降低而表达增加，体外实验证实沉默FSCN1基因可抑制胃癌细胞迁移及上皮间质转化标志物的表达，提示FSCN1可能在胃癌中发挥癌基因作用。本研究结果显示，胃癌组织中FSCN1蛋白的阳性表达率明显高于癌旁正常黏膜组织，与Wang等[18]报道一致，表明FSCN1可能与胃癌的发生有关。分析患者临床病理资料发现，胃癌患者TNM分期越重、分化程度越低，FSCN1蛋白高表达人数所占比例越大，并且FSCN1蛋白高表达与淋巴结转移有关，表明FSCN1可能参与胃癌增殖、分化、远处转移作用。生存分析显示，FSCN1高表达患者5年累积生存率及中位生存时间均低于低表达患者，与一项荟萃分析[19]结果一致，表明FSCN1可能作为胃癌发生、进展及预后的潜在标志物。最后，Cox回归分析结果显示，FSCN1蛋白高表达是影响胃癌患者预后的独立危险因素，表明FSCN1蛋白高表达患者预后不良风险增加，可能成为指示胃癌患者病情发展及预后的潜在生物指标。

既往研究发现[20-22]，FSCN1与多种肿瘤细胞的增殖分化、黏附、转移侵袭及免疫反应等方面有一定关联。本研究利用Coexpedia数据库共预测与FSCN1共表达的基因303个，且富集分析结果发现，FSCN1共表达基因主要参与细胞外基质组织、白细胞迁移、血小板活化、白细胞增殖、淋巴细胞增殖等生物学过程，富集到的主要通路包括黏着斑、阿米巴病、ECM-受体相互作用、PI3K-Akt信号通路、Hippo信号通路、细胞间黏附分子等信号通路[23]。进一步提示FSCN1可能参与胃癌的发展过程。由于肿瘤发展存在复杂的微环境改变，而抗肿瘤的疗效与自身免疫系统密切相关，因此通过分析肿瘤免疫系统可在一定程度上帮助癌症患者的免疫治疗[24-25]。本研究利用利用TCGA数据库及R3.6.3软件，分析胃癌患者FSCN1表达与免疫细胞浸润之间的关系，结果发现FSCN1表达与NK细胞、Tem细胞、浸润性树突状细胞、巨噬细胞、树突状细胞、Th1细胞、肥大细胞、浆细胞样树突状细胞、Tgd细胞、中性粒细胞、NK CD56细胞、滤泡辅助性T细胞均呈正相关，与辅助性T细胞、Th17细胞均呈负相关。提示FSCN1表达与NK细胞、辅助性T细胞等多种免疫细胞的浸润程度密切相关，其可能在胃癌免疫治疗方面具有重要的研究价值。

综上所述，胃癌组织中FSCN1蛋白高表达，其表达水平与胃癌患者TNM分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移有关，可能是指示肿瘤发生发展及患者预后的潜在标志物，有望成为胃癌免疫治疗的新靶点。FSCN1的差异表达可能与细胞骨架改变有关，可能在胃癌细胞侵袭过程中发挥重要作用，值得进一步细胞实验或动物实验研究。