热带假丝酵母菌对含油污泥的修复潜力研究

孙妩娟 王琴婷 王历历 柯从玉 张群正 王嗣昌

1.西安石油大学化学化工学院 2.中国石油长庆油田分公司油气工艺研究院

石油中含有大量的烃类、沥青质，以及蒽、芘、苯系物等有毒有害物质[1-7]，针对含油污泥的有效处理一直都是该领域的研究热点[8-12]。目前，常用的物理化学处理方法虽然能初步减缓含油污泥造成的环境问题，但不能从根本上消除含油污泥中的石油污染物，甚至还会造成二次污染[13]。

研究表明，生物法处理含油污泥不仅成本低，而且环境友好，可以真正实现含油污泥的资源化利用[14-15]。近年来，有关微生物处理含油污泥的报道越来越多，大量实验表明，微生物处理含油污泥不仅切实可行，而且具有广阔的应用前景[16-20]。目前，已报道的能够用于降解石油的微生物包括假单胞菌、无色杆菌、迪氏假丝酵母、小单孢菌、枯草芽孢杆菌及肠膜明串珠菌等，这些细菌都能以石油为唯一碳源进行生长繁殖，从而起到降解原油的目的[21-24]。此外，研究还发现，采用不同功能细菌组成的微生物群落在处理含油污泥方面比单菌株更具优势[25]。

本研究从含油土壤中筛选出了一株高效石油降解菌，鉴定为热带假丝酵母菌。通过实验，对该菌株的代谢生物表面活性剂及其对石油的乳化和降解效果进行了深入分析，研究结果对热带假丝酵母菌修复含油土壤提供理论依据，并且进一步丰富了热带假丝酵母菌的应用领域。

1 实验部分

1.1 试剂与材料

所用生化试剂盒购自中国北京利德曼生化有限公司。葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、硫酸铵、尿素、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硝酸铵、硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁和氯化钠购自中国天津天达化工厂。其他试剂为分析级，水为去离子水。

使用的仪器设备包括：红外光谱仪(5700，尼高力)、全自动表面张力仪(SIGMA700，美国热电)、紫外-可见分光光度计(756PC，上海菁华)、恒温摇床(TY-70B，苏州江东精密仪器有限公司)、生化培养箱(SPX-250BIII，天津泰斯特)和数字pH计(PHSJ-3F，力士电化)。

无机盐培养基：NH4NO34.0 g，KH2PO45.0 g，K2HPO43.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 4.0 g，微量元素溶液1 mL，1 000 mL去离子水，pH值7.2～7.4，121 ℃下灭菌20 min。微量元素溶液主要组成为：FeSO4·7H2O 1.0 g，CaCl2·2H2O 1.0 g，乙二胺四乙酸1.4 g，1 000 mL去离子水。

富集培养基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，1 000 mL去离子水，pH 值7.2～7.4，121 ℃下灭菌20 min。

YEPD固体培养基：葡萄糖2%，蛋白胨1%，酵母浸粉1%，琼脂2%。

实验所用石油及含油污泥样品取自新疆油田第二采油厂第三联合站。

1.2 实验方法

1.2.1热带假丝酵母菌的分离及鉴定

将从某油田取得的石油和油田周围被石油污染的土壤中取得的样品加入到富集培养基中，在30 ℃下摇瓶培养48 h后，对发酵液进行取样，采用梯度稀释法将其涂布在YEPD固体培养基上，30 ℃培养，然后挑取单菌落进行多次划线纯化，将纯化的菌株斜面保藏备用。

将分离得到的单菌株通过16S rRNA进行测序鉴定，采用邻接法构建16S rRNA的系统发育树，并从GenBank数据库中检索其近亲，使用MEGA 4.1软件对相关序列进行比对，以鉴定细菌种属[26]。

1.2.2菌株表面活性剂的提取、鉴定与表面张力测定

将热带假丝酵母菌发酵液用高速离心机在14 000 r/min条件下离心10 min去除菌体，上清液用6 mol/L的HCl调节pH值至小于2.0，在冰箱中于4 ℃下静置24 h，然后再离心收集沉淀，冻干提取物，于-20 ℃下储存在气密玻璃瓶中备用。

1.2.3表面活性剂红外分析

将从热带假丝酵母菌发酵液中提取得到的表面活性剂采用KBr压片，并用傅里叶变换红外光谱仪在4 000～400 cm-1区间内进行扫描，以得到其红外吸收光谱。

1.2.4薄层色谱分析(TLC)

取5 mg冻干的生物表面活性剂，用有机溶剂(氯仿或甲醇)将其溶解，并在硅胶板上点样。展开剂：m(氯仿)∶m(甲醇)∶m(乙酸)=65∶25∶1。显色剂：1.5%(w)茚三酮饱和正丁醇溶液和3 mL乙酸溶液混合。展层结束后，待硅胶板上的溶剂完全挥发，均匀地喷上显色液，放入110 ℃的烘箱，10 min后观察硅胶板上的斑点。

1.2.5表面张力的测定

将提取得到的脂肽表面活性剂配置成不同含量的溶液，然后在室温下采用吊环法测量不同含量表面活性剂溶液的表面张力值。

1.2.6菌株对石油的降解实验

将菌株接种至种子培养基中培养至对数期，按5% 接种量加入到无机盐培养基中，同时加入2%(质量分数,下同)的石油做碳源，置于恒温摇床中于32 ℃，150 r/min条件下进行培养，每天测定样品的含油率。发酵液样品中的石油采用60～90 ℃馏分石油醚进行反复萃取，直至萃取剂无色。然后采用分液漏斗分去下层水相，保留有机溶相，随后向其加入干燥好的无水硫酸钠析出多余水相，过滤定容后采用紫外分光光度法测定油含量，每个样品平行测定3次，取平均值，从而计算热带假丝酵母菌对石油的降解率。

1.2.7菌株对含油污泥的降解实验

称取含油率为5.21%的含油污泥2 000 g，将其经过粉碎、平整后，分别添加氯化铵20 g、磷酸二氢钾4.5 g、锯末100 g，搅拌均匀后加入100 mL经活化后的菌液(菌浓为108～109个/mL)，并补充水分使含油污泥总的含水率为25%～30%，待搅拌均匀后装入塑料桶内，表面撒上一层锯末，中间留透气孔，然后放入生化培养箱中控制温度30 ℃进行生化处理。在微生物处理过程中，每隔5天对含油污泥翻搅一次并补充水分，直至处理结束。处理过程中每隔一段时间取样测定含油污泥中的菌浓和含油率，每个样品平行测定3次，同时采用不加菌的含油污泥样品进行对照实验。

2 结果与讨论

2.1 热带假丝酵母菌代谢生物表面活性剂分析

2.1.1红外光谱分析

实验对热带假丝酵母菌代谢的生物表面活性剂进行红外光谱分析，结果见图1。

由图1可知：3 346.4 cm-1处为由分子间氢键引起的-NH-伸缩振动；1 635.4 cm-1处为酰胺Ⅰ谱带；1 541.1 cm-1处为酰胺Ⅱ谱带，说明此物质含有肽键。2 302.0 cm-1和2 345.3 cm-1处为膦的P-H伸缩振动；2 852.6～2 923.8 cm-1处为脂肪族甲基和亚甲基C-H的伸缩振动。由此推断，该提取物可能为脂肽类物质。

2.1.2薄层色谱分析(TLC)

实验对去除菌体后的发酵液上清液进行酸沉时发现有白色沉淀析出，因此可以推测热带假丝酵母菌代谢的生物表面活性剂为脂肽类[27]，进一步的TLC分析结果见图2。由于肽在弱酸性条件下与茚三酮反应会生成紫色物质，从图2的TLC结果可以看出，在薄层板中出现了紫色斑点，结合其表面活性特点和IR图谱(见图1)可进一步推断出热带假丝酵母代谢产生的表面活性剂为脂肽。

2.1.3热带假丝酵母菌对石油的乳化作用

实验发现，在热带假丝酵母菌的发酵过程中，无论是以葡萄糖还是石油为唯一碳源，其发酵液对石油都具有良好的乳化分散效果(见图3)。在发酵8 h后，对照样组中的石油仍漂浮在表面，而接种5%(w)热带假丝酵母菌的发酵液可将加入的石油完全乳化分散，形成O/W乳液，说明该菌株能够以石油或葡萄糖为碳源代谢脂肽表面活性剂，而且该表面活性剂具有较强的乳化活性。

实验将从热带假丝酵母菌发酵液中提取出的脂肽表面活性剂配制成不同水含量的溶液，然后采用表面张力仪测定其在不同质量浓度下的表面张力，结果如图4所示。

从图4可以看出，随着脂肽表面活性剂含量的增加，溶液表面张力逐渐降低，当脂肽质量浓度增加到80 mg/L时，溶液表面张力降至最低，为28.2 mN/m。与其他生物表面活性剂相比，热带假丝酵母菌产生的脂肽有很强的表面活性，具有显著降低溶液表面张力的作用[28]。热带假丝酵母菌能够代谢脂肽表面活性剂的这种特性为其高效降解石油奠定了良好基础，因为正是脂肽表面活性剂对石油的乳化作用才使得其菌体自身可以与石油充分接触，这进一步促进了微生物对石油的利用[19,29]。

2.2 菌株对原油的降解效果评价

热带假丝酵母菌能够以石油为唯一碳源进行生长繁殖，则意味着其能够有效降解石油。在以石油为唯一碳源条件下，实验分析了热带假丝酵母菌对石油的降解效果随时间的变化规律(见图5)。

针对初始加量为2%(w)的石油，在好氧发酵过程中，其降解率在前7 天增加显著，在第7天时降解率达到81.6%，此时大部分石油被降解，表明菌株热带假丝酵母对石油具有很高的降解效率。随着时间的进一步延长，降解率增加幅度明显降低，到第10 天时降解率达到82.5%，降解增速显著降低。其原因为在开始阶段，细菌迅速生长繁殖，菌体数量呈对数增加，而且还代谢产生大量的脂肽表面活性剂，因此，石油降解速率很快；当菌浓达到最大，且代谢产物的量也基本达到平衡以后，体系处于一个稳定期，细菌的生长繁殖和代谢速率都显著降低，而此时大部分易被微生物利用的石油组分已经被降解，因此，石油的降解速率也随之降低。

2.3 温度对热带假丝酵母菌生长繁殖及降解效率的影响

温度是影响微生物生长繁殖及代谢的重要因素。当温度太低时，细菌的活性降低，生长及代谢都会受到显著抑制；而当温度太高时，细菌的蛋白质、核酸、细胞壁和细胞膜及酶类因热力作用发生变性或凝固，活性消失，代谢发生障碍导致细菌死亡。实验测定了温度对热带假丝酵母菌菌浓及降解效率的影响，结果见图6。

从图6可以看出，热带假丝酵母菌的适宜生长温度范围为30～35 ℃，而其对石油的降解效果随温度的变化趋势与菌浓基本一致。当石油初始质量分数为2%，培养时间为5天时，其在32 ℃条件下对石油的降解率达到峰值69.2%，当温度继续升高时，细菌的生长受到抑制，菌浓反而降低，其对石油的降解效果也随之降低。

通过分析石油样品中四组分的变化发现，在微生物降解前，石油中的饱和烃、芳烃、沥青质和胶质的质量分数分别为55.56%、24.03%、11.87%和8.54%，如图7所示。而经热带假丝酵母菌降解5天后，石油中的四组分质量分数分别降低了75.04%、73.92%、61.46%和38.03%，这说明热带假丝酵母菌不仅能够利用石油中的饱和烃，而且对较难降解的芳烃及沥青质也具有良好的降解效果。

2.4 热带假丝酵母菌对含油污泥的处理效果

为了进一步验证热带假丝酵母菌对实际含油污泥样品的处理效果，实验选用从油田现场取回的含油率为5.21%的含油污泥为研究对象，考察微生物处理过程中的菌浓和含油率变化，结果见图8。

从图8可以看出，当将热带假丝酵母菌以5%(w)的接种量加入到含油污泥中以后，菌浓在第10 天时增加到1010个/g以上，并能够长期稳定在该数量级。从对石油降解效果来看，在处理90 天后，其对含油污泥中的石油降解率达到80.5%，表明热带假丝酵母菌对含油污泥具有良好的修复性能。

3 结论

(1) 从含油污泥中筛选分离出一株高效石油降解菌-热带假丝酵母菌，该菌株能够以石油为唯一碳源进行快速生长繁殖，最佳生长温度为30～35 ℃。

(2) 该菌株能够代谢生物表面活性剂脂肽，在无机盐培养基中的发酵液的表面张力可以降至28.2 mN/m，发酵液对石油具有良好的乳化作用。

(3) 热带假丝酵母菌对石油中的不同烃类组分都具有良好的降解效果，对于初始含油率为5.21 %(w)的含油污泥，其在90天内对石油降解率达到80.5%，表明热带假丝酵母菌在含油土壤的修复方面具有潜在的应用价值。