金昭胶囊对急性酒精性肝损伤小鼠的保护作用

贾 岚 孟智睿 魏益谦 李 丽 邵紫萱 高学敏 王景霞

(北京中医药大学，北京，100029)

近年来随着人民生活水平的提高和生活方式的改变，对酒类的消费也日益增多，过量饮酒已经成为全世界范围内极受关注的社会公共问题。一次大量饮酒会引发急性乙醇中毒，对机体健康产生严重危害[1]。人体摄入的乙醇90%在肝脏代谢，乙醇代谢不畅是造成酒精性肝病的主要原因[2]。中医学中没有“酒精性肝病”之名，但在中医学古文献中有“伤酒”“酒痞”“酒疸”“胁痛”等相关记载。中医学认为过量饮酒，可致湿热有毒之邪困遏脾胃，脾胃失和，胃失降浊，则气机壅滞；或损伤肝胆，致肝失疏泄，肝胆气机逆乱，病位主要在肝和胃[3]。

目前，国内外对解酒保健药的研发颇多，但尚无明确疗效的药物面向临床[4-7]。金昭胶囊由药食两用的葛根、枳椇子、栀子组成。其中葛根味辛、甘，性凉，归脾胃经。《千金方》载其“葛根主解酒毒”，能升举脾胃清阳之气，故为方中君药。枳椇子为臣药，与葛根同用，通利小便，加强酒毒排解，达到协同增效之能。栀子在配方中为佐药，可使肝、胆、脾胃酒毒从小便而出，达到很好的解酒毒利肝胆作用[8-9]。金昭胶囊将3种药食同源的中药合用，既能解毒保肝，改善临床症状，同时具有良好的安全性。现代药理学研究显示，葛根可治疗酒精性中毒[10]。高学清[11]发现葛根提取物能够有效抑制血清中GOT和GPT活性，同时能够减轻肝细胞的肿胀。枳椇子水提取物具有显著的解酒毒，抗肝纤维化，抗氧化等作用[12]。栀子具有保肝利胆的作用[13]。以上研究均为金昭胶囊防治酒精性肝、胃损伤提供了药理学方面的科学支撑。

本研究主要挖掘其产品优势，探究其对酒精性肝损伤的保护机制，提升科技含量。通过研究金昭胶囊对急性酒精性肝损伤模型小鼠醉酒状态、肝功、肝脂质及乙醇代谢酶、肝组织和胃组织抗氧化酶活性等指标的影响，对金昭胶囊对急性酒精性肝损伤的保护作用及机制进行初步探讨，为临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选取无特定病原体(Specific Pathogen Free，SPF)级雄性美国癌症研究所(Institute of Cancer Research，ICR)小鼠，周龄8～10周，体质量为25～35 g，由北京斯贝福实验动物科技有限公司提供，许可证号为SCXK(京)2016-0002，动物伦理审批号BUCM-4-2019091801-3074，动物饲养于北京中医药大学动物实验室的屏障环境中，室温为(24±2)℃，空气相对湿度为(50±10)%，光照12 h/d，自由饮水。

1.1.2 药物 金昭胶囊[无限极(中国)有限公司，批号：17C04ADB01]，规格：0.35 g/粒。茵栀黄颗粒(鲁南厚普制药有限公司，批号：Z20030028)，氯化钠(常州市海拓实验仪器有限公司，批号：20160704)。

1.1.3 试剂与仪器 氯化钠(常州市海拓实验仪器有限公司，批号：20160704)；谷丙转氨酶(Glutamic-pyruvic Transaminase,GPT)试剂盒，批号：2019001，谷草转氨酶(Glutamic-oxaloacetic Transaminase,GOT)试剂盒，批号：2019002；均购于长春汇力；三酰甘油(triacylglycerol，TG)试剂盒，批号：20190605；总胆固醇(Total Cholesterol,TC)试剂盒，批号：20190605；丙二醛(malondialdehyde,MDA)试剂盒，批号：20190510；超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)试剂盒，批号：20190327；还原型谷胱甘肽(glutathion,GSH)试剂盒，批号：20190529；过氧化氢酶(Catalase.CAT)试剂盒，批号：20190528；均购于南京建成科技有限公司；MDA试剂盒，批号：20190525；SOD试剂盒，批号：20190701；一氧化氮(Nitric Oxide，NO)试剂盒，批号：20190708；均购于南京建成科技有限公司；4%多聚甲醛，批号：30525-89-4，甘油明胶封片剂，批号：G1402，OCT包埋剂，批号：4583，武汉谷歌生物；醇脱氢酶(Alcohol Dehydrogenase，ADH)酶联免疫吸附测定试剂盒，批号：201905，醛脱氢酶(Aldehyde Dehydrogenase,ALDH)酶联免疫吸附测定试剂盒，批号：201905；均购于酶联生物；前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)酶联免疫吸附测定试剂盒，批号：C0190030183；购于华美生物。纯水仪(青岛富勒姆科技，型号：FBZ2001-UP-P)，超声细胞粉碎机(宁波新芝生物，型号：JY92-Ⅱn)，台式高速冷冻离心机(Heal Force，型号：Neofuge 15R)，涡旋混合器(Servicebio，型号：MX-F)，水浴锅(姜堰市天力医疗器械厂有限公司，型号：TL-420D)，超低温冰箱(海尔，型号：DW-86L626)，全自动研磨仪(赛维尔生物，型号：KH-Ⅲ)，自动洗板机(Rayto，型号：RT3100)，酶标检测仪(BioTeK，美国，型号：Epoch)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备

1.2.1.1 动物分组 所有ICR小鼠，适应性喂养1周，按体质量随机区组法分为空白组，模型组，茵栀黄颗粒(阳性药)组，金昭胶囊低、中、高剂量组共6组，每组10只。

1.2.1.2 金昭胶囊制备 将葛根、枳椇子和栀子(9∶4.5∶2)放入提取罐中，加10倍量的水，煎煮2次，2 h/次，提取并过滤，合并得到提取液(药材提取率为20%～25%)。将提取液浓缩至相对密度为1.0～1.5，60～85 ℃干燥至含水率≤5%，粉碎，过60～100目筛，加辅料玉米淀粉和硬脂酸镁，混合均匀，直充胶囊[14]。

1.2.1.3 模型制备 末次给药1 h后，除空白组外，其余各组灌胃50%的乙醇溶液12 mL/kg，空白组灌予等体积的蒸馏水，建立小鼠急性酒精性肝胃损伤模型[2]。

1.2.2 给药方法 金昭胶囊低、中、高剂量组小鼠每日灌胃金昭胶囊混悬液0.21 g/kg、0.42 g/kg和0.84 g/kg，灌胃体积为20 mL/kg(金昭胶囊临床成人用量2.52 g/d，动物系数按照10倍计算，成人体质量按照60 kg计算，按人体推荐摄入量的5、10、20倍折算[15])；阳性药组灌胃茵栀黄颗粒混悬液1.5 g/kg，20 mL/kg；空白对照组和模型对照组给予等体积蒸馏水灌胃,灌胃1次/d，并观察动物一般状况，称重1次/周，并按动物体质量调整灌胃量，持续给药4周。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 样本采集 在进行完醉酒状态检测后，摘眼球取血后处死，取肝脏、胃组织冻存、固定，检测相关指标。

1.2.3.2 一般行为观察 观察灌酒后小鼠行为状态、精神状态、二便状态等。

1.2.3.3 醉酒状态检测 小鼠醉酒是否以翻正反射是否消失为标准：小鼠灌酒后一定时间将其背向下轻轻侧翻，若小鼠背向下的姿势保持30 s以上，则认为翻正反射消失，即为醉酒[16]。

1.2.3.4 血清转氨酶活性 严格按照试剂盒说明书，应用全自动生化分析仪检测血清GPT和GOT的含量。

1.2.3.5 肝组织脂质水平和酶活性 严格按照试剂盒说明书，应用全自动生化分析仪检测肝组织匀浆MDA、SOD、CAT、GSH、TC、TG活性水平，应用酶标仪采用酶联免疫吸附测定法检测酒精代谢酶细胞色素ADH、ALDH的含量。

1.2.3.6 肝脏病理切片的观察 用苏木精-伊红(Hematoxylin Eosin，HE)法染色肝脏组织，切片，显微镜的放大倍数为200，观察病理学切片。

1.2.3.7 胃组织酶活性 严格按照试剂盒说明书，应用全自动生化分析仪检测胃组织匀浆MDA、SOD、NO活性，应用酶标仪采用酶联免疫吸附测定法检测胃组织匀浆PEG2水平。

2 结果

2.1 金昭胶囊对急性酒精性肝损伤小鼠行为状态的影响 灌酒后，模型组小鼠均相继出现不同程度的醉酒状态，表现为步态不稳、动作迟缓、尿失禁、昏睡等症状，提示小鼠醉酒模型构建成功。与模型组比较，金昭胶囊组与阳性药组小鼠的步态更稳、自主活动相对增加，尿失禁、昏睡症状减少，醉酒状态改善。

2.2 金昭胶囊对急性酒精性肝损伤小鼠醉酒状态的影响 灌酒后，与空白组比较，模型组小鼠醉酒数和醉酒率升高；与模型组比较，阳性药组、金昭胶囊各剂量组小鼠醉酒数和醉酒率降低。见表1。

表1 金昭胶囊对急性酒精性肝损伤小鼠 醉酒状态的影响(n=10)

2.3 金昭胶囊对急性酒精性肝损伤小鼠血清GPT、GOT活性的影响 与空白组比较，模型组小鼠血清GPT、GOT活性显著升高(P<0.01)；与模型组比较，阳性药组小鼠血清GPT、GOT活性显著降低(P<0.01，P<0.05)；金昭胶囊低、中、高剂量组小鼠血清GPT、GOT活性显著降低(P<0.01，P<0.05)。见表2。

表2 金昭胶囊对急性酒精性肝损伤小鼠血清GPT、GOT活性的影响

2.4 金昭胶囊对急性酒精性肝损伤小鼠肝组织MDA、SOD、CAT、GSH活性的影响 与空白组比较，模型组小鼠肝组织MDA活性显著升高(P<0.01)；与模型组比较，阳性药组、金昭胶囊低、中、高剂量组小鼠肝组织MDA活性显著降低(P<0.01)。与空白组比较，模型组小鼠肝组织SOD、CAT、GSH活性显著降低(P<0.01)；与模型组比较，阳性药组小鼠肝组织SOD、CAT、GSH活性显著升高(P<0.01)；金昭胶囊中剂量组小鼠肝组织GSH活性显著升高(P<0.01)；金昭胶囊高剂量组小鼠肝组织SOD、CAT、GSH活性显著升高(P<0.01)。见表3。

表3 金昭胶囊对急性酒精性肝损伤小鼠肝组织MDA、SOD、CAT、GSH活性的影响

2.5 金昭胶囊对急性酒精性肝损伤小鼠肝组织TC、TG、ADH、ALDH活性的影响 与空白组比较，模型组小鼠肝组织TC、TG活性显著升高(P<0.01)；与模型组比较，阳性药组小鼠肝组织TC、TG活性显著降低(P<0.01)；金昭胶囊低、中、高剂量组小鼠肝组织TC、TG活性显著降低(P<0.01)。与空白组比较，模型组小鼠肝组织ADH、ALDH活性显著降低(P<0.01)；与模型组比较，阳性药组小鼠肝组织ADH、ALDH活性显著升高(P<0.01，P<0.05)；金昭胶囊低剂量组小鼠肝组织ADH活性显著升高(P<0.01)；金昭胶囊中、高剂量组小鼠肝组织ADH、ALDH活性显著升高(P<0.01)。见表4。

表4 金昭胶囊对急性酒精性肝损伤小鼠肝组织TC、TG、ADH、ALDH活性的影响

2.6 金昭胶囊对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏病理学变化的影响 肝组织病理学切片结果表明，空白组小鼠肝组织结构正常，肝小叶结构完整，未见肝细胞变性、坏死等病理变化。模型组组织肝细胞排列规则，广泛可见肝细胞胞质疏松，胞质内可见微小的圆形空泡(黑色箭头)，并可见少量炎症细胞浸润(黄色箭头)，未见其他明显异常。阳性药组、金昭胶囊低、中、高剂量组组织肝细胞排列规则，广泛可见肝细胞空泡变性，胞质内可见微小的圆形空泡(黑色箭头)，未见其他明显异常。结果表明，阳性药及金昭胶囊对小鼠的肝脏具有一定程度的保护作用。见图1。

图1 小鼠肝脏组织病理切片(HE染色，×200)

2.7 金昭胶囊对急性酒精性肝损伤小鼠胃组织MDA、SOD、NO、PGE2活性的影响 与空白组比较，模型组小鼠胃组织MDA活性显著升高(P<0.01)。与模型组比较，阳性药组小鼠胃组织MDA活性显著降低(P<0.01)；金昭胶囊低、中、高剂量组小鼠胃组织MDA活性显著降低(P<0.01)。与空白组比较，模型组小鼠胃组织SOD、NO、PGE2活性显著降低(P<0.01，P<0.05)。与模型组比较，阳性药组小鼠胃组织SOD、NO、PGE2活性显著升高(P<0.01，P<0.05)；金昭胶囊低剂量组小鼠胃组织SOD活性显著升高(P<0.01)；金昭胶囊中剂量组小鼠胃组织SOD、NO活性显著升高(P<0.01)；金昭胶囊高剂量组小鼠胃组织SOD、NO、PGE2活性显著升高(P<0.01，P<0.05)。见表5。

表5 金昭胶囊对急性酒精性肝损伤小鼠胃组织MDA、SOD、NO、PGE2活性的影响

3 讨论

本研究模型组小鼠灌酒后均相继出现不同程度的醉酒状态，表现为步态不稳、动作迟缓、尿失禁、昏睡等症状，且小鼠醉酒数和醉酒率显著升高，血清中GOT、GPT水平明显升高，且肝组织形态及功能出现明显损伤改变，肝组织各指标出现了明显改变，证明急性酒精性肝损伤模型建立成功。阳性对照药茵栀黄颗粒由茵陈、栀子、黄芩组成，具有清热解毒，利湿退黄的作用[17-18]。本研究中金昭胶囊各剂量组小鼠灌酒后醉酒数和醉酒率均比模型组低，步履不稳、昏睡等醉酒症状较模型组轻。与模型组比较，血清中GOT、GPT水平明显降低，且肝组织损伤状况明显改善。从表征与肝损伤情况上看，金昭胶囊对急性酒精性肝损伤具有一定程度的保护功效。短期内乙醇的摄入过量会造成三羧酸循环障碍和脂肪酸氧化障碍，影响脂肪代谢，导致TC、TG在肝脏中大量蓄积，TG大量积聚进而造成脂肪病变，最终会导致酒精性脂肪肝的形成[19-20]。当肝组织受到损伤，乙醇在代谢过程中产生过量的活性氧损伤肝细胞膜，肝细胞膜的通透性增大，存在于肝细胞质内的GPT和肝细胞线粒体中的GOT会大量进入血清[21-22]。本研究金昭胶囊各剂量组显著降低急性酒精性肝损伤小鼠血清GPT、GOT水平，肝组织TC、TG水平，改善肝组织细胞肿胀、坏死、炎症细胞浸润等病理状态，说明金昭胶囊对急性酒精性肝损伤小鼠的保护机制可能与调节转氨酶水平，脂质水平有关。

SOD是机体内广泛存在的清除氧化自由基的酶类，它与CAT、GSH共同构成体内的抗氧化系统，可以有效地清除机体产生的自由基，对维持机体内自由基的平衡起着至关重要的作用[9，23]。MDA是活性氧自由基氧化生物膜过程中产生的脂质过氧化产物，可以与酶和蛋白质交联从而生成脂褐质，改变膜的通透性，其水平的高低与氧化应激对肝脏的损害程度相关[24-25]。SOD是生物体抗氧化酶防御体系的主要组成部分，其酶活性的降低将导致氧自由基蓄积，从而诱导细胞损伤。GSH是机体内最重要的非酶性抗氧化物，是评价机体抗氧化能力大小的重要因素[26]。本研究金昭胶囊各剂量组显著降低急性酒精性肝损伤小鼠肝组织MDA水平，升高SOD、CAT、GSH水平，说明金昭胶囊对急性酒精性肝损伤小鼠的保护机制可能与调节抗氧化水平有关。

乙醇在人类体内的代谢和排泄是一个复杂的、多系统参与的过程。摄入的乙醇90%在肝脏代谢降解,可引起肝脏脂质过氧化反应，使肝细胞膜及细胞器结构遭到破坏从而引起代谢和功能方面的障碍[27-29]。经胃肠道吸收的乙醇通过胞质ADH和线粒体ALDH途径、微粒体乙醇氧化系统途径及内质网途径氧化代谢，上述代谢过程产生的大量自由基介导了氧化应激反应，从而损伤肝细胞[30]。ADH通过将乙醇代谢为乙醛，再经ALDH代谢形成乙酸，最后通过三羧酸循环排出体外[9]。本研究金昭胶囊各剂量组显著降低急性酒精性肝损伤小鼠肝组织ADH、ALDH含量，说明金昭胶囊对急性酒精性肝损伤小鼠的保护机制可能与调节乙醇代谢酶有关。

胃是乙醇代谢最先接触的重要器官，过度饮酒或长期饮酒可引起胃黏膜急性或慢性损伤。在乙醇的刺激下，胃黏膜组织可产生大量氧自由基，氧自由基与膜内多价不饱和脂肪酸结合，形成MDA[31]。SOD是机体清除氧自由基的重要酶，可通过歧化反应清除机体内氧代谢过程中产生的有害超氧负离子自由基。PGE2是胃黏膜重要的调控介质，在组织中的减少与多种因素导致的胃黏膜损伤有关[32]。NO具有扩张黏膜血管，调节免疫应答及作为神经递质等作用，可增加胃黏膜血流量，从而维护黏膜完整性，发挥黏膜防御作用[33]。本研究金昭胶囊各剂量组显著降低急性酒精性肝损伤小鼠胃组织MDA活性，增加SOD、NO、PGE2活性，说明金昭胶囊对急性酒精性肝损伤小鼠的胃组织也有一定保护作用，且对胃黏膜的保护机制可能与调节过氧化物酶有关。

综上所述，金昭胶囊具有解酒的作用，对于急性酒精性肝损伤有明显的保护作用，其作用机制可能与增强体内肝组织中乙醇代谢关键酶及抗氧化酶活性，减少脂质过氧化物的产生，保护肝细胞膜完整性，减少转氨酶的释放相关。同时金昭胶囊还可以通过调节胃组织过氧化物酶活性，起到保护胃黏膜损伤的作用。说明金昭胶囊对于饮酒过量所导致的肝、胃损伤均有良好的保护作用。