基于网络药理学探讨三棱-莪术药对治疗子宫内膜异位症的作用机制

宗春晓 徐 信 谢 伟 刘小丽 薛晓鸥 王 谦 徐 立

(北京中医药大学第一临床医学院，北京，100010)

子宫内膜异位症(Endometriosis,EMT)指子宫内膜组织(腺体和间质)出现在子宫体以外的部位，临床症状以痛经、慢性盆腔痛、月经失调、不孕等为主。近年来EMT发病率呈上升趋势，严重影响患者的健康及生命质量[1-2]。虽然目前用于治疗EMT的药物种类很多，但存在长期服用不良反应多、停药后易复发等弊端。

中医药治疗EMT在临床取得良好疗效，具有较好的应用前景。EMT在中医学古文献中无确切病名记载，但根据其主要临床症状与体征，可归属于“痛经”“癥瘕积聚”“月经不调”“不孕”等范畴。唐容川《血证论》云：“离经之血，虽清血鲜血，亦是瘀血。”EMT患者的异位内膜组织随雌孕激素的变化出现周期性出血，故认为血瘀是贯穿EMT发生发展过程的中心环节，EMT的基本病机为“瘀血阻滞胞宫、冲任”，因此，活血化瘀是治疗EMT的常法[3-4]。

三棱-莪术药对为活血化瘀最常用的药对之一，二者配伍使用首见于《经验良方》，属于相须配伍关系。三棱、莪术皆辛散苦泄，为破血消癥之品，其中三棱性平，破血祛瘀之力较强，莪术性温，破气消积之力较强，二者相须为用，共奏破血逐瘀、消癥止痛、行气散积之功。武梅等[5]关于EMT中医用药规律的研究表明，三棱-莪术药对为中医药治疗EMT使用最多的药对。临床研究报道，三棱-莪术药对治疗EMT取得较好疗效，但其作用机制仍有待深入研究[6-8]。网络药理学具有整体性和系统性的特点，是研究中药和疾病复杂关系的有效方法[9]。本研究拟采用网络药理学方法，通过筛选三棱-莪术药对的活性成分和作用靶点，从系统生物学的角度探索三棱-莪术药对治疗EMT的作用机制。

1 资料与方法

1.1 三棱-莪术药对活性成分的挖掘与筛选 将三棱、莪术两味中药分别输入中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)进行检索，通过设置口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥30%和类药性(Drug Likeness，DL)≥0.18 2个筛选条件，得到各自的活性成分。

1.2 三棱-莪术药对活性成分作用靶点的预测 利用TCMSP数据库获取三棱-莪术药对筛选出的活性成分所对应的潜在靶点信息，通过UniProt(http://www.Uniport.org)数据库中的UniProtKB搜索功能对靶点进行检索，设置背景为Homo sapiens(人类)，得到所有靶点的official gene symbol，以用于后续分析。

1.3 EMT靶点的挖掘 GeneCard(http://www.genecards.org)是人类基因的综合数据库，可提供简明的基因组学、蛋白质组学、转录组学的基因信息。人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，http://www.omim.org)是关于人类基因和遗传紊乱的数据库，包含所有已知的遗传病、遗传决定的性状及其基因信息。利用GeneCard和OMIM获得EMT这一疾病的相关治疗靶点信息。

1.4 核心靶点筛选及疾病-药物-活性成分-靶点相互作用网络的构建 利用韦恩图在线绘制工具(http://www.bioinformatics.com.cn)绘制三棱-莪术药对有效活性成分靶点和EMT靶点的韦恩图，将其交集靶点定义为三棱-莪术药对治疗EMT的核心靶点。利用Cytoscape 3.7.2软件构建三棱-莪术药对治疗EMT的疾病-药物-活性成分-靶点相互作用网络图。

1.5 蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)网络构建和分析 将筛选得到的三棱-莪术药对治疗EMT的交集靶点蛋白以gene symbol的形式上传到String数据库(http://string-db.org)，限定研究物种为Homo sapiens，进行PPI分析，得到PPI网络。将筛选得到的三棱-莪术药对治疗EMT的34个交集靶点上传到String数据库进行PPI分析，得到PPI网络。通过Cytoscape 3.7.2软件进行网络构建并绘制按Degree值排序的PPI网络。在所构建的PPI网络中，节点大小和颜色变化反映了Degree值大小，节点越大、颜色越红的靶点Degree值越大，在网络中越处于核心位置。

1.6 基因本体(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析 利用Bioconductor生物信息软件包(http://www.bioconductor.org)，借助R软件，首先将基因名字转化为基因ID，然后设定P≤0.05进行GO功能富集分析与KEGG通路富集分析，选取P值前20的条目制图。并利用Cytoscape 3.7.2软件构建靶点-信号通路网络图，进一步说明靶点和信号通路在三棱-莪术药对治疗EMT中的作用。红色为信号通路，绿色为靶点。

2 结果

2.1 三棱-莪术药对的活性成分 共得到三棱-莪术药对的8个活性成分，其中三棱5个，莪术3个。表1为活性成分详细信息。

表1 三棱-莪术药对活性成分

2.2 三棱-莪术药对活性成分靶点预测及EMT靶点挖掘 获得三棱-莪术药对活性成分所对应的靶点共77个；检索GeneCard和OMIM数据库得到1 600个EMT相关靶点。得到34个交集靶点即三棱-莪术药对治疗EMT的核心靶点。见图1。详细信息见表2。

图1 三棱-莪术药对与EMT交集靶点韦恩图

表2 三棱-莪术药对治疗EMT相关靶点

2.3 疾病-药物-活性成分-靶点相互作用网络的构建 利用Cytoscape 3.7.2软件构建疾病-药物-活性成分-靶点相互作用网络，得到了一个包含42个节点(Node)和93条边(Edge)的网络。见图2。图中黄色代表疾病，红色代表药物，紫色代表三棱的活性成分，蓝色代表三棱莪术共有的活性成分，绿色代表靶点。其中，自由度(Degree)值排名前6的靶点是前列腺素内过氧化物合酶2(Prostaglandin-endoperoxide Synthase2,PTGS2)、前列腺素内过氧化物合酶1(Prostaglandin-endoperoxide Synthase1,PTGS1)、核受体辅激活蛋白2(Nuclear Receptor Coactivator 2,NCOA2)、视黄酸X受体A(Retinoid X Receptor Alpha，RXR-α，RXRA)、孕酮受体(Progesterone Rceptor,PGR)、神经元乙酰胆碱受体亚基α-7(Neuronal Acetylcholine Receptor Subunit Alpha-7,CHRNA7)，它们的Degree值分别是6、6、5、4、4、4。

图2 三棱-莪术药对治疗EMT的疾病-药物-活性成分-靶点相互作用网络

2.4 PPI网络的构建和分析 结果显示，该网络含有34个节点，157条边，平均节点Degree值为9.24。见图3。通过Cytoscape 3.7.2软件进行网络构建并绘制按Degree值排序的PPI网络见图4。图5为Degree值排名前30的靶点。PPI网络中处在核心位置的靶点主要有胱天蛋白酶3(Caspase-3,CASP3)、原癌基因c-Jun(Proto-oncogene c-Jun,JUN)、PTGS2、雌激素受体(Estrogen Receptor,ESR1)、促分裂原活化的蛋白激酶14(Mitogen-activated Protein Kinase 14,MAPK14)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome Proliferator Activated Receptor Gamma,PPARG)、内皮型一氧化氮合酶(endothelial Nitric Oxide Synthase 3,eNOS3)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性脱乙酰酶沉默信息调节因子1(Ailence Infor-mation Regulator，sirtuin-1,SIRT1)、雄激素受体(Androgen Receptor,AR)、胱天蛋白酶9(Caspase-9，CASP9)、白细胞介素4(Interleukin-4,IL4)。这些靶点是连接网络中其他节点的枢纽，在PPI网络中起关键作用，可能是三棱-莪术药对治疗EMT的重要靶点。

图3 三棱-莪术药对治疗EMT的PPI网络

图4 三棱-莪术药对治疗EMT的PPI网络(按Degree值排序)

图5 Degree值排名前30位的三棱-莪术药对治疗EMT的靶点

2.5 GO功能富集分析 GO功能富集分析共得出1 054个生物过程(Biological Process,BP)，涉及对类固醇激素的反应、节律过程、生殖结构发育、生殖系统开发、对雌二醇的反应、对氧气水平的反应、细胞对类固醇激素刺激的反应、对缺氧的反应、对氧气水平降低的反应、排卵周期等；22个细胞组分(Cellular Component,CC)，涉及膜筏、膜微区、膜区、核染色质、线粒体外膜、细胞器外膜、外膜、肥大细胞颗粒、孔复合体、质膜筏等；65个分子功能(Molecular Function,MF)，涉及核受体活性、转录因子活性、类固醇激素受体活性、核激素受体结合、激素受体结合、凋亡过程中半胱氨酸型内肽酶活性、核受体结合、RNA聚合酶Ⅱ转录因子结合、转录共激活因子活性、类固醇结合等。见图6～7。柱状图长度越长则富集基因数目越多，颜色越红则富集越显著；气泡图节点越大则富集基因数目越多，颜色越红则富集越显著。

图6 三棱-莪术药对治疗EMT的GO功能富集分析柱状图

图7 三棱-莪术药对治疗EMT的GO功能富集分析气泡图

2.6 KEGG信号通路富集分析 得到一个包含66个节点和243条边的网络，Degree值最大的靶点主要有JUN、MAPK14、CASP3、BAX、CASP8。图中红色为信号通路，绿色为靶点，节点越大的靶点Degree值越大。见图8。KEGG通路富集分析共得到91条通路，其共同靶点主要富集于雌激素信号通路、乙肝、弓形虫病、大肠癌、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染、小细胞肺癌、白细胞介素17(Interleukin-17，IL-17)信号通路、糖尿病并发症中晚期糖基化终产物(Advanced Glycation End Products,AGE)-AGE受体(Receptor of AGE,RAGE)信号通路、多物种凋亡、利什曼病、EB病毒(Epstein-Barr Virus,EBV)感染、麻疹、乳腺癌、非酒精性脂肪肝疾病、内分泌抵抗、甲状腺激素信号通路、铂耐药、P53信号通路、细胞凋亡等。见图9。气泡图节点越大则富集基因数量越多，颜色越红则富集越显著。

图8 三棱-莪术药对治疗EMT的靶点-信号通路网络

图9 三棱-莪术药对治疗EMT的KEGG富集分析气泡图

3 讨论

EMT为妇科常见疾病，近年来发病率持续上升，严重影响患者的生命质量。西医药物存在不良反应大、停药后易复发的弊端。中医学认为，异位内膜的周期性出血为离经之血，属于“瘀血”的范畴，“瘀血阻滞胞宫、冲任”是EMT的基本病机，血瘀是EMT最基本的病理基础。赵玉芹[10]关于EMT中医证型分布规律的研究表明,气滞血瘀证占EMT证型的比例最大，治疗以理气行滞、化瘀止痛为法。三棱-莪术为行气止痛、活血化瘀的常用药对，临床治疗EMT取得了良好的疗效。张锡纯《医学衷中参西录》云：“莪术、三棱性近和平，而以治女子瘀血，虽坚如铁石亦能徐徐消除，而猛烈开破之品不能建此奇功，此莪术、三棱独具之良能也。”三棱为血中气药，善行气中之滞；莪术为气中血药，善破血中之结。二者相须为用，共奏行气活血，散瘀消癥之功。现代药理研究表明，莪术具有抗血小板聚集、抗血栓的作用，可降低血液黏度，改善血液流变学，且能抗炎镇痛，抗痛经及改善大鼠血清激素水平紊乱[11-14]。三棱具有抗炎镇痛、抑制血管生成、抑制血小板聚集及抗血栓作用[15-18]。但三棱-莪术药对治疗EMT的作用机制尚未完全明确，网络药理学从多靶点出发，从分子信息学、分子生物学及现代药理学的角度对中药配伍规律及作用机制进行探究，通过网络学科语言呈现出中药多成分、多靶点和多途径的复杂作用关系，与中医整体论治的观念相一致[19-20]。本研究利用网络药理学平台技术，对三棱-莪术药对治疗EMT的作用机制进行了预测。

本研究借助TCMSP，以OB≥30%、DL≥0.18为筛选条件，共得到三棱-莪术药对的8个活性成分，通过TCMSP筛选得到77个三棱-莪术药对活性成分所对应的靶点，检索GeneCard和OMIM数据库得到1 600个EMT相关靶点，取交集后得到34个三棱-莪术药对治疗EMT的核心靶点。借助Cytoscape软件构建疾病-药物-活性成分-靶点相互作用网络，显示三棱-莪术药对具有多成分、多靶点治疗EMT的作用特点,其中Degree值排名前6位的靶点为PTGS2、PTGS1、NCOA2、RXRA、PGR、CHRNA7，提示三棱-莪术药对治疗EMT的作用机制涉及炎症反应、激素调控、免疫调节等。通过String数据库和Cytoscape软件得到PPI网络图，提示蛋白之间存在着复杂的联系，是一个复杂交互的网络而非单线作用，因此靶点之间的相互作用调节可能是三棱-莪术药对治疗EMT的潜在机制之一。筛选出的核心靶点主要有CASP3、JUN、PTGS2、ESR1、MAPK14、PPARG等，其中胱天蛋白酶3属于胱天蛋白酶蛋白家族成员，位于细胞凋亡有序级联反应的下游，是细胞凋亡的关键执行者，其活化标志着细胞凋亡进入不可逆阶段。多项研究已表明，EMT的发生发展与子宫内膜组织细胞凋亡的失调有关[21-24]。

从GO功能富集分析可知，三棱-莪术药对治疗EMT可影响1 054个生物学过程，65个分子功能和22个细胞组分。主要涉及的生物学过程包括对类固醇激素的反应、节律过程、生殖结构发育、生殖系统开发、对雌二醇的反应、对氧气水平的反应、细胞对类固醇激素刺激的反应、对缺氧的反应、对氧气水平降低的反应、排卵周期等，多生物学过程与代谢通路为深入探讨三棱-莪术药对治疗EMT的作用机制提供了科学依据。

从KEGG富集分析结果可知，三棱-莪术药对治疗EMT所涉及的通路主要有雌激素信号通路、IL-17信号通路、AGE-RAGE信号通路、甲状腺激素信号通路、P53信号通路等，通路上所含靶点越多则该通路发挥作用的可能性越大。EMT是雌激素依赖性疾病，局部高水平的雌激素是EMT发生的关键。EMT患者的雌激素受体1表达升高，刺激异位内膜生长，而异位病灶又能持续合成雌激素。雌激素可激活MAPK、WNT、核因子κB、PI3K-AKT、Notch等信号通路，调控上皮孕激素受体、凋亡调节剂B细胞淋巴瘤-2等的表达，参与EMT的发生发展[25-28]。研究表明，EMT异位病灶的炎症反应是影响其发生发展的重要因素，IL-17是一种炎症介质，可以激活核因子κB、MAPK等信号通路，上调IL4、环氧合酶2等的表达，促进炎症反应[29-30]。近年来研究发现,AGE-RAGE信号通路中的晚期糖基化终产物受体在EMT患者异位内膜细胞中过表达[31]。本研究结果表明，RAGE可与多种配体结合，激活PI3K-AKT、Jak-STAT、MAPK信号通路及钙离子信号通路等，促进胱天蛋白酶3、白细胞介素1、白细胞介素6等因子的表达，诱导细胞凋亡、促进炎症反应，从而促进EMT的发展。EMT与甲状腺激素通路有关。研究表明，甲状腺刺激激素在EMT患者和对照组患者的子宫内膜中均起着增生和氧化性激素的作用，而三碘甲状腺素和甲状腺素则可以特异性地增加异位子宫内膜细胞的增殖和活性氧的产生。动物实验研究证实，当小鼠甲状腺激素增加时，其子宫内膜异位植入物会增大[32]。P53是一种肿瘤抑制基因，参与细胞周期调控、DNA修复、细胞凋亡等重要的生物学过程。临床研究报道，80%以上的EMT恶变患者P53蛋白过度表达，而其在正常子宫内膜及异位内膜中很少表达,提示P53基因突变在EMT恶变中起重要作用[33]。

综上所述，三棱-莪术药对治疗EMT具有多靶点、多途径、多通路的特点，其主要作用可能与雌激素信号通路、IL-17信号通路、AGE-RAGE信号通路、甲状腺激素信号通路、P53信号通路等有关。本研究基于网络药理学，初步阐述了三棱-莪术药对治疗EMT的潜在靶点和信号通路，为进一步深入研究三棱-莪术药对治疗EMT的作用机制奠定了基础。但由于中药相互作用的复杂性及网络药理学本身所具有的局限性，本研究所得结果可能存在一定的偏差，仍有待进一步验证。