以壳聚糖为基底的分子印迹电化学传感器研究及倍硫磷测定

凌 俊，杨光炜，李建平，2*

（1.桂林理工大学 环境科学与工程学院，广西 桂林 541004；2.桂林理工大学 化学与生物工程学院，广西 桂林 541004）

倍硫磷是一种中等毒性、应用广泛、残效期长的有机磷杀虫剂［1］，其在环境中具有一定的持久性，可通过进入水体和食物链对人和动物构成威胁［2-3］。因此，环境中倍硫磷的检测受到人们的广泛关注。目前常用的倍硫磷检测方法主要有气相色谱法［4］、液相色谱法［5］、色谱-质谱联用法等［6］，但这些方法对复杂样品中微量物质的测定存在耗时，样品处理过程繁杂，且需要复杂的大型仪器以及训练有素的专业检测人员等缺点［7］，难以用于日常筛查。因此，急需开发一些成本低、操作简单、选择性好、灵敏度高的农药分析方法。

分子印迹聚合物（MIP）电化学传感器集分子印迹技术的高效识别特性与电化学分析灵敏度高、检测快速、仪器简便、易于小型化等优点于一体，广泛应用于环境样品中微量污染物的分析测定［8-11］。但利用MIP 电化学传感器测定倍硫磷少有文献报道［12］，已有方法的灵敏度低（检出限仅为0.05µg/g），不能满足痕量倍硫磷的检测要求。提高MIP 电化学传感器检测方法的灵敏度一直是分析工作者的研究热点［12］。利用门控制效应能显著提高印迹传感器检测的灵敏度［14-15］。该法利用模板分子洗脱后，以MIP 上留下的印迹孔穴作为电极与溶液界面上的“门”控制从底液到达电极的探针离子的量。由于底液中的探针浓度高，开启少量“门”即可使大量探针进入，导致电流急剧增加，产生类似三极管的放大效应。然而，基于扩散电流检测的伏安分析方法灵敏度仍有待提高。

壳聚糖是自然界唯一的碱性多糖，价格低廉，具有良好的粘附性和成膜特性。目前，利用壳聚糖构建分子印迹传感器已有较多报道［16-18］，然而这些方法中壳聚糖仅作为印迹膜用于模板分子的识别或仅用于固定功能材料。研究表明壳聚糖分子链上分布大量氨基［19-20］，这些氨基在酸性条件下带正电，能与阴离子以静电引力结合［21］，并将阴离子或络阴离子吸附于电极表面［22］，从而产生远大于扩散电流的吸附电流。据此，本文首次提出了基于壳聚糖修饰层增敏的MIP-门控制效应测量法，并考察了壳聚糖修饰层的增敏效果。通过将壳聚糖修饰至电极，并在其表面电聚合制备倍硫磷的MIP 膜，得到MIP 电化学传感器。由于壳聚糖能够通过静电引力对带负电的铁氰酸根阴离子探针产生吸附和富集作用，导致电流信号急剧增加，方法灵敏度显著提高，可用于环境样品中痕量倍硫磷的测定。传感器的制备和检测原理见图1。

图1 壳聚糖增敏的MIP传感器的制备过程和检测原理Fig.1 Preparation process and detection principle of chitosan-sensitized MIP sensor

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Autolab PGSTAT128N 工作站（Eco Chemie，Utrecht，瑞士）；CHI660E 电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）；三电极体系（武汉高仕睿联科技有限公司）：铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，玻碳电极为工作电极；pHS-2C型精密酸度计（上海雷磁精密仪器有限公司）。

倍硫磷和邻苯二胺购自上海阿拉丁生化科技有限公司；无水乙醇、硝酸、乙酸、铁氰化钾、亚铁氰化钾、氯化钾、十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠购自西陇科学股份有限公司。所有试剂均为分析纯，实验用水均为二次蒸馏水（18.2 MΩ·cm）。

1.2 MIP电化学传感器的制作

将玻碳电极依次使用0.3、0.05µm 氧化铝粉在麂皮上打磨抛光后，依次用体积比为1∶1 的硝酸、无水乙醇及水将电极洗净，晾干备用。

取10µL经1%乙酸配制的质量分数为0.16%的壳聚糖溶液，滴涂到电极表面，在60 W的白炽灯下照射干燥20 min，得到壳聚糖修饰的电极。

将壳聚糖修饰的电极放至含50 mg/L倍硫磷和1×10-3mol/L邻苯二胺的PBS缓冲溶液（0.2 mol/L，pH 7.4）中电聚合制备倍硫磷的MIP膜。电聚合方法为循环伏安法（CV），在0 ～0.8 V电位下扫描20圈，扫描速率为50 mV/s。将聚合MIP膜的电极用水冲洗，自然放干后，放入乙酸-乙醇（1∶8，体积比）洗脱液中缓慢搅拌，将MIP膜上的倍硫磷洗脱后，即制得有倍硫磷印迹孔穴的MIP电化学传感器。电聚合MIP膜的步骤中不加入倍硫磷，其他实验条件相同，以此制备非分子印迹（nMIP）电化学传感器作比较。

1.3 测试方法

电化学测试在5×10-3mol/L 铁氰化钾溶液中进行。用CV 和交流阻抗法（EIS）对分子印迹膜进行表征，CV 的扫描电位为-0.2 ～0.6 V，扫描速率为50 mV/s，EIS 的交变电压为5 mV，频率范围为100 mHz ～100 kHz。

样品测试时，将制备好的电极放入待测液中，重吸附270 s，用水冲洗电极后，转移至5×10-3mol/L中，吸附富集90 s，用差分脉冲伏安法（DPV）进行电化学信号测试，扫描电位为-0.2 ～0.6 V，振幅为0.05 V。

2 结果与讨论

2.1 MIP电化学传感器的电化学表征

2.1.1 循环伏安法表征以作为探针，对MIP 电化学传感器进行电化学表征。结果如图2A 所示，曲线a 表明探针在玻碳电极上有明显的氧化还原峰，这是因为在电极表面发生了氧化还原反应；将壳聚糖修饰在玻碳电极上（曲线b），由于壳聚糖带正电，通过静电作用对阴离子探针进行吸附富集，氧化还原峰明显增大；当在壳聚糖修饰的电极表面电聚合形成MIP膜后（曲线c），由于电极表面形成了一层致密且导电性差的MIP膜，其氧化还原峰基本消失；对MIP膜上的倍硫磷进行洗脱（曲线d），留下与倍硫磷三维结构相匹配的印迹孔穴，这些印迹孔穴可为探针提供传递通道，氧化还原峰明显增大；但随着MIP 的重吸附后（曲线e），印迹孔穴对倍硫磷进行识别与吸附，导致传递通道堵塞，氧化还原峰减小。由于nMIP膜不存在倍硫磷，洗脱后不会产生倍硫磷的印迹孔穴，因此在聚膜（曲线f）、洗脱（曲线g）和重吸附（曲线h）过程中，氧化还原峰无明显变化。上述实验结果表明，MIP膜制备成功，该MIP电化学传感器对倍硫磷具有特异性识别能力。显然，门控制效应原理是上述CV法表征的依据。

图2 分子印迹电化学传感器的CV（A）及EIS（B）表征Fig.2 CV（A）and EIS（B）characterization of molecularly imprinted electrochemical sensora. bare GCE；b. chitosan-modified GCE；c. electropolymerization MIP；d. after MIP elution；e. after MIP resorption；f. electropolymerization nMIP；g. after nMIP elution；h. after nMIP resorption

2.1.2 交流阻抗表征采用交流阻抗法表征该MIP 电化学传感器在制备和使用的不同阶段时，其电极表面阻抗的变化（见图2B）。结果显示，玻碳电极的阻抗很小（曲线a）；修饰壳聚糖后电极的阻抗依然很小（曲线b）；在修饰壳聚糖的电极表面电聚合MIP膜后，由于MIP膜致密且导电性差，阻抗急剧增大（曲线c）；将MIP上的倍硫磷洗脱后，印迹膜上出现印迹孔穴，探针可通过通道到达电极表面，阻抗减小（曲线d）；MIP传感器上的印迹膜重吸附倍硫磷后，部分印迹孔穴被重新占据，探针的传递通道减少，电极表面阻抗增大（曲线e）。该EIS 表征结果与CV 表征结果基本一致，证明对倍硫磷有识别能力的MIP电化学传感器已成功制备。

2.2 壳聚糖对测量信号的影响

考察了修饰壳聚糖后对MIP电极信号的影响。图3中a0和b0分别为洗脱后的壳聚糖修饰MIP电极和无壳聚糖MIP 电极在5 × 10-3mol/L Fe溶液中的空白电流曲线，a 和b 分别为吸附50 pg/mL 倍硫磷后的电流曲线。可看出壳聚糖修饰MIP 电极的空白信号明显高于无壳聚糖修饰MIP 电极；而吸附相同浓度倍硫磷后，壳聚糖修饰MIP 电极的电流变化值ΔIa明显大于无壳聚糖修饰MIP 电极的ΔIb，前者约为后者的2.6倍。

图3 壳聚糖的加入对测量信号的影响Fig.3 Effect of chitosan on the measurement signala0 and a were chitosan-modified MIP electrode in blank solution and 50 pg/mL fenthion；b0 and b were the molecularly imprinted sensor without chitosan modification in blank solution and 50 pg/mL fenthion，respectively

2.3 实验条件的优化

2.3.1 壳聚糖滴涂量的优化考察了壳聚糖滴涂量对电流信号的影响。在2 ～10µL 范围内，随着壳聚糖滴涂量的增加，电极表面逐渐形成壳聚糖修饰层，实现对探针的吸附富集，导致电化学信号逐渐增大；而当滴涂量超过10µL时，电流值反而逐渐减小。这是由于壳聚糖修饰层厚度较大时，电极导电性变差，电流反而减小。因此，选择壳聚糖的最佳滴涂量为10µL。

2.3.2 MIP 膜模板分子洗脱和重吸附时间的优化考察了MIP 的洗脱时间和重吸附时间的影响，结果如图4所示。随着洗脱时间的增加，倍硫磷不断被洗脱，孔穴增多，产生的信号增大，但当洗脱到120 s 时，信号基本不变，表明MIP 电化学传感器已基本洗脱完成，故选择最佳洗脱时间为120 s（图4 曲线a）。在30 ～270 s 内，随着吸附时间的增加，倍硫磷的吸附量逐渐增加，导致印迹孔穴被堵塞，探针的电信号减少；当吸附时间达270 s 时，吸附达到饱和，电流值保持不变。因此，选择270 s为最佳重吸附时间。

图4 洗脱时间（a）及重吸附时间（b）的优化Fig.4 Optimization of elution time（a）and resorption time（b）

2.3.3 探针吸附富集时间的优化壳聚糖在静电作用下对阴离子探针进行吸附富集。因此，考察了探针的吸附富集时间对电流信号的影响。结果表明，在0 ～90 s 内，随着吸附时间不断增加，电流信号不断变大；当吸附时间超过90 s时，电流信号趋于平稳，表明壳聚糖对探针已吸附饱和。因此，选择最佳吸附时间为90 s。

2.4 MIP电化学传感器的分析性能

在最佳实验条件下，将制备好的MIP电化学传感器置于不同浓度的倍硫磷标准溶液中进行重吸附270 s，放入Fe（CN）4-6/Fe（CN）3-6中对探针进行吸附富集90 s，然后用DPV 法记录电流值，结果如图5所示。随着倍硫磷质量浓度的增大，电流信号逐渐减小，表明MIP对倍硫磷的吸附量不断增加。其中，电流变化值（ΔI）与倍硫磷浓度在1 ～10000 pg/mL范围内呈良好线性关系，线性方程为ΔI=23.09logC（pg/mL）+12.65，线性相关系数r2=0.9981。根据检出限（DL）=3δb/K计算得到DL为0.35 pg/mL。与其他倍硫磷检测方法相比，本方法具有更低检出限（表1）。

图5 重吸附不同浓度倍硫磷溶液后的DPV响应曲线及校准曲线Fig.5 DPV response curves and calibration curve after resorption of different concentrations of fenthion fenthion concentration（a-m）：0，1，2.5，5，25，50，100，250，500，1000，2500，5000，10000 pg/mL

表1 不同倍硫磷检测方法的性能比较Table 1 Performance comparison of different methods for the detection of fenthion

2.5 MIP电化学传感器的选择性

为了验证分子印迹电化学传感器的特异性识别能力，考察了质量浓度为50 ng/mL（100 倍）的草甘膦、氟乐林、氟虫腈、甲基对硫磷、杀草强、西维因等农药对测定500 pg/mL倍硫磷的影响。将制备的传感器分别放入上述干扰物中进行重吸附后，进行电信号的检测（图6）。结果显示，这些农药对倍硫磷的干扰较小，表明该传感器具有良好的选择性。

图6 MIP电化学传感器的选择性Fig.6 Selectivity of MIP electrochemical sensor

2.6 传感器的重现性与稳定性

在相同条件下制备5个传感器，对质量浓度为500 pg/mL 倍硫磷的信号变化进行考察，5 支电极的电流值的相对标准偏差为2.4%，说明该传感器的重现性良好。

将制备好的MIP电极置于5 ℃冰箱中保存不同时间后对500 pg/mL 倍硫磷溶液进行测定，结果表明，放置3 d 后对倍硫磷的响应值减小1.1%，7 d后减小3.6%，15 d 后仅减小5.9%。说明该传感器具有良好的稳定性。

2.7 实际样品的检测

为考察该MIP 电化学传感器实际应用的可行性，对蔬菜水果中的倍硫磷进行检测。称取来源于农贸市场的蔬菜水果各10 g，剪碎，加入10 mL乙腈作为提取剂，经超声、离心后，取上清液，放进5 ℃冰箱待用。将制备好的MIP 电化学传感器置于待测液中重吸附270 s 后，放入Fe（CN）4-6/Fe（CN）3-6中吸附富集90 s，再测量DPV 电流信号。采用标准加入法对传感器的实际性能进行分析，结果见表2。分析结果的加标回收率为99.0%～109%，相对标准偏差（RSD）为1.9%～2.9%。表明该传感器在实际检测中具有较好的检测效果。

表2 蔬菜水果样品中倍硫磷的检测及加标回收率Table 2 Detection and recovery of fenthion in vegetable and fruit samples

3 结论

本文研制了壳聚糖修饰的倍硫磷分子印迹电化学传感器，利用壳聚糖对探针阴离子的富集作用，提高分子印迹传感器检测的灵敏度。该传感器对倍硫磷的测定检出限达0.35 pg/mL，已应用于蔬菜水果样品中倍硫磷的测定。本方法灵敏度高、选择性好、操作简单、稳定性好。这种利用壳聚糖对探针阴离子的富集作用提高灵敏度的检测方法为研制其它分子印迹传感器提供了有益的借鉴。