新型类过氧化物纳米酶NC@MIL-100（Fe）的制备及其对生物硫醇的测定

王佩瑶，张凌怡，张维冰

（华东理工大学 化学与分子工程学院 上海市功能性材料化学重点实验室，上海 200237）

天然酶在自然界中发挥着非常重要的作用，但其制备成本高、储存条件严格，具有一定的局限性［1］。纳米酶是具有类似天然酶催化活性的无机纳米材料，作为新一代的人工酶，具有成本低、稳定性好等优点，弥补了天然酶的不足，成为近年来的研究热点。自2007年Fe3O4纳米粒子作为过氧化物酶的模拟物被发现以来［2］，大量基于纳米酶的研究不断涌现。典型的纳米酶包括碳纳米材料（如碳纳米管、氧化石墨烯、碳量子点），金属纳米粒子（如Ag、Au、Pt、Pd），金属氧化物（如Fe3O4），金属有机框架材料（Metal organic frameworks，简称MOFs）及各种复合材料等。纳米酶已被运用在越来越多的领域，如对离子、分子、癌细胞等的检测，对环境污染物的处理，在抗菌、抗癌、抗氧化方面的应用等［3］。

MOFs 是由金属离子/簇与有机配体配位而成的多孔材料，具有大量的活性位点，研究表明MIL-53、MIL-88、MIL-100 和MIL-101 等MOFs 具有良好的催化活性［4］。如MIL-53（Fe）被证明具有类过氧化物酶活性，在H2O2的存在下可以催化3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（TMB）和邻苯二胺（OPD）的氧化，并实现对H2O2的比色检测［5］。MOFs 材料具有良好的类过氧化物酶活性，Valekar 等［6］使用N，N，N'，N'-四甲基-1，4-丁二胺（TMBDA）将MIL-100（Fe）功能化后与胆碱和乙酰胆碱特异性酶结合，成功地检测了牛奶和血清中分别存在的胆碱和乙酰胆碱。Xu等［7］采用微波辅助法合成了Fe3O4@MIL-100（Fe），证实该材料具有良好的类过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性，发展了简单有效的谷胱甘肽比色检测法，该方法的线性范围为1 ～45µmol/L，检出限（LOD）为0.26µmol/L。

碳纳米材料作为典型的类酶材料，成为纳米酶研究的热点。Song 等［8］合成了羧基修饰的氧化石墨烯（GO-COOH），并成功用于葡萄糖的检测。Zhang等［9］制备了ZIF-8-还原氧化石墨烯（ZIF-8-rGO）负载的双金属（AuPt）纳米颗粒，并作为一种新型的过氧化物酶模拟物用于H2O2的高灵敏度检测。Li等［10］将氮杂原子（N）掺杂到Q-石墨烯（QG）中，制备得到的碳基纳米酶具有高特异性的类过氧化物酶催化活性，其催化性能大大提高。煤系针状焦（NC）是以煤焦油、沥青及其重要馏分为原料［11］制成的固体炭材料，在显微镜下具有明显的针状纹理结构，片层状结构堆积整齐［12］，其结构及组成与石墨烯相似，可用于制备特种炭素材料及其复合材料、超高功率电极［11］等。目前将石墨烯作为纳米酶的研究较多，然而并无基于针状焦的纳米酶的相关报道。考虑到针状焦的低成本及其与石墨烯的相似性，发展基于针状焦的新型复合纳米酶具有极大的应用潜力。

生物硫醇主要包括谷胱甘肽和半胱氨酸，在人体代谢中起着至关重要的作用。体液中这些低分子量硫醇的异常水平与一些疾病密切相关，包括糖尿病、癌症和心血管疾病等［13］，因此发展谷胱甘肽和半胱氨酸的检测方法具有重要的生物学意义。目前已发展了各类材料用于生物硫醇的检测，如FeS2/SiO2［14］、MoS2@CoFe2O4［15］、Ru@G［16］、Fe3+［17］等。Liu等［18］利用灵芝多糖还原并功能化氧化石墨烯，并将得到的材料用于半胱氨酸检测，检出限为0.1µmol/L，线性范围为2 ～30µmol/L；Deng 等［19］制备了铁和氮共掺杂的石墨烯量子点，实现了复方氨基酸片中半胱氨酸的检测；Wu等［20］合成了石墨氮化碳并将其应用于血清样品中半胱氨酸的检测。

本文以针状焦为基底，利用其与MIL-100（Fe）间的静电相互作用制备了复合材料NC@MIL-100（Fe），对材料进行表征并研究了其类过氧化物酶活性。以NC@MIL-100（Fe）为纳米酶发展了谷胱甘肽和半胱氨酸的分析方法，优化了分析条件，并进一步应用于实际样品人血清中生物硫醇浓度的检测。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

煤系针状焦由鞍山热能院提供；均苯三甲酸（H3BTC）购于西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；乙醇、硝酸、氯化钾购于上海凌峰试剂有限公司；精氨酸（Arg）购于上海百灵威化学技术有限公司；九水硝酸铁（Fe（NO3）3·9H2O）、30%过氧化氢（30% H2O2）购于国药集团化学试剂有限公司；谷胱甘肽（GSH）、二甲基亚砜（DMSO）、L-半胱氨酸（Cys）、甘氨酸（Gly）购于上海麦克林生化科技有限公司；无水乙酸钠（NaAc）、3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（TMB）、氯化钠、氯化镁、乙酸（HAc）、L-组氨酸（His）、酪氨酸（Tyr）等其他氨基酸购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；健康人血清来自复旦大学附属中山医院；实验所用试剂均为分析纯；实验用水均为超纯水。

S-3400N 扫描电子显微镜（SEM，日本日立公司）；JEM-1400 生物透射电子显微镜（TEM，日本电子株式会社）；FT-IR 6700傅里叶变换红外光谱仪（美国尼高力公司）；D/max2550VB/PC X 射线衍射仪（XRD，日本理学电机）；UV-2550紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）。

1.2 NC@MIL-100（Fe）的制备

将14.43 g Fe（NO3）3·9H2O 与5.04 g H3BTC 溶于36 mL 水中，超声1 h，随后转移至反应釜中160 ℃下反应12 h，之后加水在70 ℃下搅拌3 h，再加乙醇在65 ℃下搅拌3 h以洗去杂质。最后将所得材料置于50 ℃真空烘箱下过夜烘干，得到MIL-100（Fe）［21］。

称取500 mg针状焦，倒入60 mL浓硝酸，60 ℃油浴下搅拌7 h，水洗至中性后置于50 ℃烘箱过夜，得到酸化后的针状焦。

将7.21 g Fe（NO3）3·9H2O与2.52 g H3BTC溶于18 mL水中，取25 mg酸化后的针状焦溶于50 mL水。将以上两种溶液分别超声1 h，之后将两者混合搅拌1 h，转移至反应釜中150 ℃下反应15 h。反应完成后，将材料离心，之后加水在70 ℃下搅拌3 h，再加乙醇在65 ℃下搅拌3 h，洗去杂质。最后将所得材料置于90 ℃烘箱下过夜烘干，得到NC@MIL-100（Fe）。

1.3 NC@MIL-100（Fe）的类过氧化物酶活性研究

将4.8µL TMB（10 mg/mL）、100µL 30%的H2O2及20µL NC@MIL-100（Fe）（1 mg/mL）与0.2 mol/L的NaAc-HAc（pH 3.6）缓冲液混合，使反应液总体积为1 mL。随后在37 ℃下孵育，用紫外-可见分光光度计检测其在500 ～800 nm 波长范围的吸收光谱，并考察其在652 nm 波长下的吸光度随时间的变化曲线。作为对比，针状焦和MIL-100（Fe）也在相同条件下测试。

在保持其他条件一致的情况下，考察了不同的H2O2浓度（0.1 ～5 mmol/L），TMB浓度（0.1 ～4 mmol/L），纳米酶质量浓度（2 ～100µg/mL）及孵育时间（5 ～30 min）下，反应体系在652 nm波长下吸光度的大小。

取20µL NC@MIL-100（Fe）（1 mg/mL），不同体积（1.2、2.4、4.8、7.2、9.6、12、16.8、24µL）的TMB溶液（10 mg/mL）与0.2 mol/L的NaAc-HAc（pH 3.6）缓冲液混合，37 ℃下孵育20 min，加入100µL 30%的H2O2使反应液总体积为1 mL，检测其在652 nm波长下的吸光度随时间的变化。将吸光度增加速率转换为催化反应速度v，并将v和底物浓度拟合到米氏方程，计算动力学常数Vmax和Km。米氏方程如下所示：

其中Vmax为饱和底物浓度下的最大反应速率，［S］是底物的浓度，Km是米氏常数。Km反映了纳米酶对其底物的亲和力，定义为最大速率一半时的底物浓度，Km越小说明材料对底物的亲和力越强。

以H2O2为底物时，取20µL 的NC@MIL-100（Fe）（1 mg/mL），不同体积（1、2、4、6、8、10、14、20 µL）的H2O2溶液（50 mmol/L）与0.2 mol/L 的NaAc-HAc（pH 3.6）缓冲液混合，37 ℃下孵育20 min，加入120µL TMB溶液（10 mg/mL）使反应液总体积为1 mL，其他步骤同上。

1.4 对生物硫醇的检测

将4.8 µL TMB 溶液（10 mg/mL），20 µL H2O2溶液（50 mmol/L），20 µL 的NC@MIL-100（Fe）（1 mg/mL），不同体积（0、0.6、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、16、18µL）的谷胱甘肽溶液（5 mmol/L）与0.2 mol/L的NaAc-HAc（pH 3.6）缓冲液混合，使反应液总体积为1 mL，37 ℃下孵育20 min，用紫外-可见分光光度计检测其在500 ～800 nm 波长处的吸收光谱。检测半胱氨酸时，则将谷胱甘肽溶液替换为不同体积（0、1、10、20、30、40、50、60、70、80、100、120、140、160、180µL）的半胱氨酸溶液（1 mmol/L），其他条件同上。

将4.8 µL TMB 溶 液（10 mg/mL），20 µL H2O2溶 液（50 mmol/L），20 µL NC@MIL-100（Fe）（1 mg/mL），20µL 浓度为5 mmol/L 的组氨酸（His）、谷氨酸（Glu）、色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、酪氨酸（Tyr）、赖氨酸（Lys）、脯氨酸（Pro）、天冬氨酸（Asp）、精氨酸（Arg）、Na+、Mg2+和K+溶液与0.2 mol/L 的NaAc-HAc（pH 3.6）缓冲液混合，使反应液总体积为1 mL。在37 ℃下孵育，并检测其在652 nm波长下的吸光度。

将4.8 µL TMB 溶 液（10 mg/mL），20 µL H2O2溶 液（50 mmol/L），20 µL NC@MIL-100（Fe）（1 mg/mL），健康人血清与0.2 mol/L 的NaAc-HAc（pH 3.6）缓冲液混合，使反应液总体积为1 mL 且最终人血清的浓度被稀释10 倍。在37 ℃下孵育，并在652 nm 波长下检测其吸光度。将吸光度变化值转化为浓度，即可得到人血清中生物硫醇的含量。加标实验分别将200µmol/L 和400µmol/L 的半胱氨酸加入上述反应体系中，使其最终浓度被稀释10倍，计算血清中生物硫醇的实际浓度和回收率。

2 结果与讨论

2.1 NC@MIL-100（Fe）的制备与表征

由于煤系针状焦表面基团较少，为了使MIL-100（Fe）顺利吸附，首先用浓硝酸氧化针状焦，在其表面引入羟基、羧基等基团。利用酸化后的针状焦与MIL-100（Fe）间的静电相互作用制备NC@MIL-100（Fe）具有成本低、一次制备产量较大、制备方法简单等优势。

采用扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）对材料的形貌进行表征，结果如图1 所示。针状焦呈片层状结构，MIL-100（Fe）为直径约100 nm 的颗粒；而从NC@MIL-100（Fe）的电镜图可看出，基于针状焦的片层结构，MIL-100（Fe）能较为均匀地分布在其上，减少了MIL-100（Fe）的团聚现象。

图1 NC（A）、MIL-100（Fe）（B）、NC@MIL-100（Fe）（C）的SEM图及NC（D）、MIL-100（Fe）（E）、NC@MIL-100（Fe）（F）的TEM图Fig.1 SEM images of NC（A），MIL-100（Fe）（B），NC@MIL-100（Fe）（C）and TEM images of NC（D），MIL-100（Fe）（E），NC@MIL-100（Fe）（F）

图2A 为材料的XRD 表征结果。可看出针状焦在26.3°（002）［21］处出现了较强的衍射峰；MIL-100（Fe）在5.3°（333）、10.8°（428）、14.2°（088）、18.2°（7911）、24°（6618）和27.7°（9321）处出现了衍射峰，与文献报道一致［22］；而在NC@MIL-100（Fe）中，MIL-100（Fe）的衍射峰均有出现，但针状焦的衍射峰并不明显，可能是因为MIL-100（Fe）较多的覆盖在针状焦的表面。图2B为材料的红外光谱图，针状焦中3424、1654、1631、1051 cm-1处的峰分别对应O—H、—C==O、—C==C、—C—O基团；MIL-100（Fe）中3417、1623、1574、1446、758、711 cm-1处的峰分别对应O—H基团和苯环［23］；而在NC@MIL-100（Fe）中，针状焦和MIL-100（Fe）的特征峰均有出现。图2C为材料的N2吸附-脱附等温线，可得到针状焦、MIL-100（Fe）和NC@MIL-100（Fe）的BET比表面积分别为20.53、1354.92、912.38 m²/g。复合材料NC@MIL-100（Fe）仍保持了较大的比表面积。以上表征均证明NC@MIL-100（Fe）成功合成。

图2 NC、MIL-100（Fe）和NC@MIL-100（Fe）的XRD图谱（A）、红外光谱（B）和N2吸附-脱附等温线（C）Fig.2 XRD patterns（A），FT-IR spectra（B）and N2 adsorption-desorption isotherms（C）of NC，MIL-100（Fe）and NC@MIL-100（Fe）

2.2 类过氧化物酶活性研究

为了考察NC@MIL-100（Fe）材料作为纳米酶的性能，对其类过氧化物酶活性进行了研究。由于类过氧化物酶在H2O2的存在下可以催化TMB的氧化，使反应体系由无色变为蓝色，因此使用紫外-可见分光光度计对反应体系的吸光度进行检测，以吸光度的变化值为参数评价NC@MIL-100（Fe）的类酶活性。首先检测了相同条件下，针状焦、MIL-100（Fe）和NC@MIL-100（Fe）的吸收光谱及吸光度随时间的变化曲线。如图3A 所示，NC@MIL-100（Fe）在652 nm 下的吸光度明显高于单独的针状焦与MIL-100（Fe）；图3B 显示在相同时间下，NC@MIL-100（Fe）吸光度的变化值最大，说明在单位时间内NC@MIL-100（Fe）的催化性能优于针状焦与MIL-100（Fe）。

图3 NC、MIL-100（Fe）、NC@MIL-100（Fe）的紫外-可见吸收光谱（A）及吸光度随时间的变化曲线（B）Fig.3 UV-Vis absorption spectra of NC，MIL-100（Fe），NC@MIL-100（Fe）（A）and the curves of absorbance versus time（B）conditions：4.8µL TMB（10 mg/mL），100µL 30%H2O2 and 20µL NC@MIL-100（Fe）（1 mg/mL）

对纳米酶催化条件进行优化（图4），分别考察了其他条件不变时不同H2O2浓度、TMB 浓度、纳米酶质量浓度和孵育时间对反应体系相对吸光度的影响。结果显示催化反应的最佳条件为1 mmol/L H2O2、3 mmol/L TMB、80µg/mL NC@MIL-100（Fe）和20 min的孵育时间。

图4 不同的H2O2浓度（A）、TMB浓度（B）、纳米酶质量浓度（C）及孵育时间（D）对反应体系相对吸光度的影响Fig.4 The effect of different H2O2 concentrations（A），TMB concentrations（B），nanozyme mass concentration（C）and incubation time（D）on the relative absorbance of the reaction systemconditions：24µL TMB（10 mg/mL），20µL H2O2（50 mmol/L），20 min incubation time and 20µL NC@MIL-100（Fe）（1 mg/mL）

分别以TMB 和H2O2为底物，研究了各材料的类过氧化物酶催化动力学，结果见表1。经过对比发现，针状焦的Km和Vmax较小，说明针状焦对底物的亲和力较高，但催化反应速度较慢；MIL-100（Fe）的Km和Vmax较大，说明其催化反应速度较快，但对底物的亲和力较低；而不论是以TMB 还是以H2O2作为底物，NC@MIL-100（Fe）的Km值均介于针状焦与MIL-100（Fe）之间，且Vmax值大于针状焦和MIL-100（Fe），说明该材料结合了针状焦和MIL-100（Fe）的优势，对底物的亲和力较高且催化反应速度较快，具有良好的类过氧化物酶活性。

表1 各材料的动力学参数Table 1 The kinetic parameters of each material

表2列举了其他纳米酶和本文合成的纳米酶的催化动力学常数。在分别以TMB和H2O2为底物的情况下，与辣根过氧化物酶（HRP）相比，NC@MIL-100（Fe）的Km值比HRP小1.61倍和8.6倍，说明该材料比天然酶对底物的亲和力更强；与其他纳米酶相比，NC@MIL-100（Fe）也表现出较为优异的催化效果。

表2 各种纳米酶Km值与Vmax值的对比Table 2 Comparison of Km and Vmax value of various nanozymes

（续表2）

2.3 对生物硫醇的检测

基于NC@MIL-100（Fe）良好的类过氧化物酶活性，将其应用于谷胱甘肽和半胱氨酸的分析。由于谷胱甘肽和半胱氨酸含有巯基，加入反应体系后将与TMB竞争H2O2因被还原而产生的羟基［15］，导致被氧化的TMB 含量减少，从而使反应体系的蓝色变浅。如图5A 和图5B 所示，随着谷胱甘肽或半胱氨酸浓度的增加，反应体系在652 nm下的吸光度逐渐减小。以吸光度的变化值（ΔA）为纵坐标，不同的谷胱甘肽和半胱氨酸浓度为横坐标绘制散点图（图5C 和图5D），发现在较高浓度下ΔA趋于饱和。在3 ～70µmol/L 范围内ΔA与谷胱甘肽的浓度呈线性关系，方程为ΔA=0.0143cGSH+9×10-6（r2=0.998），检出限（LOD，3σ/S）为0.33µmol/L；在1 ～80µmol/L 范围内ΔA与半胱氨酸的浓度呈线性关系，方程为ΔA=0.0095cCys+0.0184（r2=0.998），LOD（3σ/S）为0.22µmol/L。

图5 加入不同浓度谷胱甘肽（A）和半胱氨酸（B）的吸收光谱及体系吸光度随两者浓度的变化值（C、D）Fig.5 The UV absorption spectra（A，B）and changes in absorbance（C，D）with different concentrations of GSH and Cysconditions：20µL H2O2（50 mmol/L），4.8µL TMB（10 mg/mL）and 20µL NC@MIL-100（Fe）（1 mg/mL）

表3为多种纳米酶检测谷胱甘肽和半胱氨酸的线性范围及LOD 值。相比其他材料，NC@MIL-100（Fe）检测的线性范围更宽，且LOD较小，是检测谷胱甘肽和半胱氨酸的良好材料。

表3 各纳米酶对谷胱甘肽和半胱氨酸的线性范围及LOD的比较Table 3 Comparison of the linear ranges and LODs of GSH and Cys detected by various nanozymes

2.4 反应体系的选择性

研究了其他氨基酸及离子对反应体系的干扰情况。加入浓度均为100µmol/L的谷胱甘肽、半胱氨酸及干扰物质，并检测反应体系的吸光度。由图6可知，包含谷胱甘肽和半胱氨酸的反应体系吸光度发生了明显变化，溶液褪色明显。以半胱氨酸为例，在几种干扰物质中，组氨酸、谷氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、精氨酸对反应体系具有一定的干扰，其浓度为100 µmol/L 时，相对误差为10.6% ～18.9%；其它组分的干扰较小，浓度为100µmol/L 时，相对误差为0.5%～8.3%，说明反应体系对谷胱甘肽和半胱氨酸的检测具有较好的选择性。但应注意的是，若检测过程中，反应体系内存在能被羟基自由基氧化的其他还原性物质，则该还原性物质也会与TMB 竞争羟基自由基，从而对生物硫醇的检测产生干扰。

图6 体系对GSH和Cys检测的选择性Fig.6 Selectivity of detection for GSH and Cysconditions：the interfering substance is 100µmol/L，and other conditions are the same as those in Fig.5

2.5 实际样品测定

由于人血清中半胱氨酸的浓度远高于谷胱甘肽的浓度［25］，因此以血清中半胱氨酸为分析对象。检测结果如表4 所示，人血清中生物硫醇的浓度为178 µmol/L，测定的相对标准偏差为（RSD）为4.2%。向上述样品中分别加入200、400µmol/L 的半胱氨酸标准溶液进行加标实验，得到其回收率为94.5%～103%，RSD 为2.3%～2.4%。结果表明该方法在实际样品中的检测效果良好。但基于本方法的检测原理，如果样品中同时含有谷胱甘肽和半胱氨酸，则本方法不能实现两者的分别测定，仅能对其总量进行估测。

表4 NC@MIL-100（Fe）用于人血清中半胱氨酸浓度的检测Table 4 NC@MIL-100（Fe）for the detection of Cys concentration in human serum

3 结论

本文以针状焦为基底，通过其与MIL-100（Fe）间的静电相互作用制备了新型纳米酶NC@MIL-100（Fe），并应用于谷胱甘肽和半胱氨酸的分析。NC@MIL-100（Fe）不仅原料成本较低、使用量小、合成方法简单，且对底物的亲和力较高，催化反应速度较快。NC@MIL-100（Fe）作为性能优良的纳米酶，有望在生物样品分析和疾病诊断等领域发挥重要作用。