超快速液相色谱-三重四极杆-线性离子阱质谱法同时测定桑寄生中多元活性成分

吴 楠，袁嘉欢，王文辛，刘训红，2*，黎 理，殷圣鑫，陈海杰，薛 佳，周永逸，杨 薇

（1.南京中医药大学 药学院，江苏 南京 210023；2.江苏省经典名方工程研究中心，江苏 南京 210023；3.广西中医药大学 药学院，广西 南宁 530200）

桑寄生Taxillus sutchuenensis（Lecomte）Danser为桑寄生科半寄生性灌木，以干燥带叶茎枝入药，首载于《神农本草经》［1］。其具有祛风湿、补肝肾、强筋骨、安胎元的功效，用于风湿痹痛，腰膝酸软，筋骨无力，崩漏经多，妊娠漏血，胎动不安，头晕目眩［2］。桑寄生主要分布在广西、福建、广东等地，当地人常采摘其茎枝和叶熬汤或制成茶饮［3］，用以养生保健。现代药理研究表明，桑寄生具有神经保护作用，以及镇痛、抗炎、抗肿瘤、降血压、血糖、血脂等作用［4-7］。其主要活性成分为黄酮类、有机酸类、挥发性成分、磷脂、维生素、微量元素及凝集素等［8-11］。

在前期样品采集中发现，所收集的桑寄生商品药材中叶的比例极低，可能由于传统采收期为秋冬季落叶量较多或是采收、干燥、运输过程中叶片碎裂导致，这在一定程度上对桑寄生的有效性和安全性造成影响。此前，朱开昕等［12］研究发现桑寄生老叶中的槲皮素含量高于嫩芽及对照品药材；苏本伟等［13］发现槲皮苷、槲皮素及扁蓄苷主要存在于桑寄生叶中，茎枝中含量较少。2020版《中国药典》中并未明确桑寄生的指标成分，而目前对桑寄生的研究集中在单一黄酮类成分或总黄酮［12-14］，由于中药作用的整体性、成分的多样性以及成分间相互作用的难以预测性，使得对单一活性成分的检测缺乏代表性［15-16］。为了更加全面地反映桑寄生药材的质量，本文选择桑寄生中4类成分包括12种黄酮类、4种有机酸类、12种氨基酸类和5种核苷类共33种活性成分进行研究。采用超快速液相色谱-三重四极杆-线性离子阱质谱（UFLC-QTRAP-MS/MS）进行测定，有效克服了以往桑寄生化学成分研究中普遍使用的高效液相色谱法（HPLC）中复杂体系分离困难的问题，可同时定量分析多个化合物，分析时间大幅缩短且灵敏度显著提高［17-20］。结合独立样本t检验及相关性分析对数据进行分析，对比桑寄生茎枝、叶的成分含量差异，以期为桑寄生资源的合理利用提供参考，为建立相应的质量安全标准奠定基础。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

AB SCIEX QTRAP 5500质谱仪配有电喷雾离子源和Analyst 1.6.3软件（美国ABSciex公司）；SIL-20A XR 超快速液相色谱仪，包括LC-20AD XR溶剂输送泵、DGU-20A3脱气机、SIL-20A XR自动进样器、CTO-20AC柱温箱（日本Shimadzu公司）；DHG-91140A恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；KQ-500B型超声波清洗器（500 W，40 kHz，江苏昆山超声仪器有限公司）；BSA224S型电子分析天平、ME36S型电子分析天平（德国Sartorius公司）；H1650-W高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）。

对照品：儿茶素、槲皮素-3-O-（6″-没食子酰基）-β-D-半乳糖苷、槲皮素-3-O-（6″-没食子酰基）-β-D-葡萄糖苷、金丝桃苷、扁蓄苷、槲皮素、原儿茶酸、阿魏酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、酪氨酸、腺苷、2′-脱氧腺苷、肌苷、鸟苷、2′-脱氧鸟苷购于上海源叶生物科技有限公司；槲皮素-3-O-葡萄糖酸苷购于南京良纬生物科技有限公司；芦丁、没食子酸、绿原酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、脯氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸购于中国食品药品检定研究院；槲皮苷购于中国药品生物制品检定所；山奈苷购于成都埃法生物科技有限公司；异槲皮苷、异樱花素购于成都克洛玛生物科技有限公司。化合物的纯度均大于98%。甲醇、甲酸为色谱纯，购于Merck公司；实验用水为Milli-Q超纯水。

1.2 样品信息

桑寄生采集于广西省，采收后立即干燥。经南京中医药大学药学院刘训红教授鉴定为桑寄生科（Loranthaceae）植物桑寄生（Taxillus sutchuenensis（Lecomte）Danser）的干燥带叶茎枝。样品的采收信息见表1。留样凭证存放于南京中医药大学中药鉴定实验室。

表1 桑寄生样品的信息Table 1 Sample informations of Taxilli Herba

1.3 对照品溶液制备

精密称取各对照品适量，分别加入70%甲醇配制成对照品储备液。取各对照品储备液适量，加70%甲醇定容至10 mL 容量瓶中配成混合对照品溶液，逐级稀释得到一系列不同质量浓度的工作溶液，置于4 ℃冰箱保存备用。

1.4 供试品溶液制备

取桑寄生干燥样品，粉碎后过50目筛。精密称定药材粉末0.5 g，置于具塞锥形瓶中，加入70%甲醇15.5 mL，密封后称定重量，超声（500 W，40 kHz）32 min，冷却，以70%甲醇补足减失重量，摇匀过滤，滤液离心（12000 r/min，10 min）后收集上清液，稀释10倍，经0.22µm滤膜过滤即得。

1.5 分析条件

1.5.1 色谱条件色谱柱为XBridge®C18色谱柱（4.6 mm×100 mm，3.5µm）；柱温为30 ℃；流动相为0.1%甲酸水（A）-甲醇（B）；梯度洗脱程序：0 ～5 min，2% ～27% B；5 ～8 min，27% ～31% B；8 ～14 min，31%～32%B；14 ～17 min，32%～34%B；17 ～22 min，34%～40%B；22 ～26 min，40%～73%B；26 ～29 min，73%～2%B；体积流速为0.5 mL/min；进样量为2µL。

1.5.2 质谱条件电喷雾离子源（ESI），正离子（ESI+）和负离子（ESI-）模式同时切换扫描；多反应监测模式（MRM）；喷雾电压（IS）：4500 V（ESI+），-4500 V（ESI-）；离子源温度（TEM）：550 ℃；气帘气（CUR）：275790 Pa，流速：40 L/min；雾化气（GS1）和辅助气（GS2）：413685 Pa，流速：55 L/min；接口加热，全程通入氮气。

2 结果与讨论

2.1 供试品制备方法的优化

2.1.1 单因素实验根据文献报道，桑寄生中游离槲皮素的含量较少，主要以槲皮苷形式存在［21］，所以本实验以槲皮苷的提取率作为响应值，对甲醇体积分数（40%、50%、60%、70%、80%、90%）、液料比（10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1）（mL∶g）及提取时间（20、30、40、50、60、70 min）3 个重要因素进行考察。由图1可知，当甲醇的体积分数为50%～70%时，槲皮苷的提取率随着甲醇体积分数的增大而增大，当甲醇体积分数继续升高时，提取率反而下降。其次，随着料液比及提取时间的增大，提取率均随之上升，但提取率在液料比达到30∶1时开始下降，而当提取时间≥30 min时，提取率趋于稳定。因此选择甲醇体积分数为70%，液料比为30∶1，提取时间为30 min。

图1 单因素实验结果Fig.1 Results of single factor experimentA：methanol concentration；B：liquid to material ratio；C：extraction time

2.1.2 Box-Behnken响应面优化实验在单因素实验的基础上，以甲醇体积分数（X1）、液料比（X2）和提取时间（X3）为考察因素，根据Box-Behnken响应面法进行三因素三水平的实验设计，以槲皮苷的提取率（Y）为响应值，进行响应面分析。实验设计及结果见表2。应用Design-Expert 8.0.6对数据进行多元线性回归和二项式拟合， 得到回归方程为Y= 3.93 + 0.074X1+ 0.091X2+ 0.035X3- 0.360X1X2-0.085X1X3- 3.00 × 10-3X2X3-。对回归模型进行方差分析，结果见表3。P＜0.0001，F=33.39，表明回归模型具有高度显著性。同时，失拟项P=0.7715 ＞0.05，无显著性，说明响应值与预测值之间有较好的拟合度和可信度。利用软件绘制各因素交互作用对响应值影响的响应面图，响应曲面坡度越大，表明该因素对响应值的影响越大。如图2所示，各因素对响应值影响的大小顺序为甲醇体积分数＞液料比＞提取时间。

图2 各因素交互作用的响应面图Fig.2 Response surface plot of interaction of various factors

表2 Box-Behnken实验因素、水平及结果Table 2 Factors，levels and results of Box-Behnken experiments

表3 响应面实验结果的方差分析Table 3 Variance analysis of response surface experiments results

2.1.3 模型验证通过对回归方程求解，得到最佳提取条件如下：甲醇体积分数为70%，液料比（mL∶g）为30.60∶1，提取时间为31.79 min，此时预测的响应值为3.94 mg/g。为方便实际操作，将上述条件调整为甲醇体积分数70%，液料比31∶1，提取时间32 min。在该条件下，进行3 次平行实验验证模型的可靠性。结果表明，平均提取率为3.77 mg/g，与预测值相差0.17%，较为接近。表明优化后的提取条件是可靠的。

2.2 色谱条件的优化

考察了XBridge®C18（4.6 mm × 100 mm，3.5 µm）和 SynergiTMHydro-RP 100 Å（2.0 mm × 100 mm，2.5 µm）两种色谱柱对33种目标成分的分离效果，结果表明，前者对化合物的分离效果和色谱峰形均优于后者，因此实验选择XBridge®C18柱（4.6 mm ×100 mm，3.5µm）。此外，对不同的流动相系统（水-甲醇、水-乙醇、水-乙腈、0.1%甲酸水-甲醇）、柱温（25、30、35 ℃）和流速（0.3、0.5、0.8 mL/min）进行了考察。结果表明，在30 ℃柱温下，以0.1%甲酸水和甲醇为流动相，0.5 mL/min流速进行梯度洗脱，可达到最佳分离效果。

2.3 质谱条件的优化

在电喷雾离子源正、负离子模式下，将质量浓度为100 ng/mL的目标成分标准溶液注入质谱仪进行全扫描。结果表明，氨基酸类、核苷类成分及扁蓄苷在正离子模式下有较强的响应和更好的峰形，而其他黄酮类及有机酸类成分在负离子模式下的响应值更高，所以分别选择正、负离子模式进行检测。同时优化去簇电压（DP）、碰撞能量（CE）等参数，得到最佳质谱参数见表4，混合标准品的总离子流图见图3。

图3 桑寄生中33种目标成分混合标准品的总离子流图Fig.3 Total ion chromatogram（TIC）of standard mixture of 33 target constituents in Taxilli Herba the peak numbers denoted were the same as those in Table 4

表4 33种目标成分的质谱参数Table 4 Mass spectrometric parameters of 33 constituents

（续表4）

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系、检出限与定量下限取“1.3”配制的系列浓度工作溶液按“1.5”条件进样测定。以各成分的峰面积为纵坐标（Y），对应的质量浓度为横坐标（X，ng/mL），得到33个目标成分的标准曲线。并分别以信噪比（S/N）约为3 和10 计算各成分的检出限（LOD）和定量下限（LOQ），结果见表5。结果显示，33种目标成分在各自的质量浓度范围内均呈良好的线性关系，相关系数（r）均不低于0.9990， LOD 和LOQ 分 别 为0.13 ～66.85 ng/mL和0.42 ～222.83 ng/mL。

表5 33种目标成分的回归方程、相关系数、线性范围、检出限和定量下限Table 5 Linear equations，correlation coefficients，linear ranges，limits of detection and limits of quantitation of 33 constituents

（续表5）

2.4.2 精密度、重复性与稳定性取“1.3”中混合对照品溶液，连续进样6次，按照本方法测定33种目标成分的峰面积，计算得到各成分的日内相对标准偏差（RSD）为1.1%～3.3%；每天进样3次，连续进样分析3 d，计算各成分的日间RSD为0.97%～3.9%（表6），表明该仪器具有良好的精密度。精密称取同一样品（S10-2）6份制备供试品溶液，按“1.5”方法进样分析，计算33种目标成分的RSD为1.4%～4.7%（表6），表明该方法的重复性良好。取S10-2样品，按“1.4”方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h时进样测定，记录峰面积，计算33种目标成分的RSD为0.86%～4.6%（表6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

表6 33种目标成分的精密度、重复性、稳定性与加标回收率Table 6 Precisions，repeatabilities，stabilities and recoveries of 33 constituents

（续表6）

2.4.3 加标回收率精密称定9份已知33种成分含量的桑寄生样品粉末0.25 g，分别添加低、中、高3个水平（80%、100%、120%）的混合标准品溶液，每个水平3个平行，按“1.4”方法制备供试品溶液，进样测定各成分的含量，并计算回收率和RSD（见表6）。结果显示，33 种目标成分的平均回收率为98.0%～101%，RSD为1.0%～3.4%，表明本方法的准确度良好。

2.5 样品含量测定

分别精密称取各批次的桑寄生样品粉末约0.5 g，按“1.4”方法制备供试品溶液，平行3 份，按“1.5”条件进样分析，并以标准曲线法计算各样品中33种目标成分的含量，结果见表7。

表7 33种目标成分的含量测定结果（n=3，µg/g）Table 7 The content determination results of 33 constituents（n=3，µg/g）

2.6 数据分析

2.6.1 相关性分析基于表7 数据，通过SPSS 21.0软件分别对14批桑寄生样品茎枝、叶中的33种目标成分进行Spearman相关性分析，结果见图4。结果表明，不同氨基酸成分之间的相关性较强，普遍存在显著的正相关，以质量分数较高的谷氨酸为例，其与赖氨酸、组氨酸、精氨酸、丝氨酸、脯氨酸、缬氨酸及苯丙氨酸呈极显著正相关（P＜0.01）；组氨酸的质量分数较低，但其与赖氨酸、精氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸及苯丙氨酸呈极显著正相关（P＜0.01），与缬氨酸、亮氨酸呈显著正相关（P＜0.05）。除肌苷与2'-脱氧腺苷、鸟苷呈极显著正相关（P＜0.01）外，其余各核苷类成分之间普遍存在正相关，但相关性不显著（P＞0.05）。不同有机酸类成分中，没食子酸与原儿茶酸、阿魏酸呈显著正相关（P＜0.05），绿原酸与阿魏酸呈极显著正相关（P＜0.01），其余各有机酸之间均呈现不同程度的正相关，但相关性不显著（P＞0.05）。槲皮苷与槲皮素、芦丁、槲皮素3-O-（6"-没食子酰基）-β-D-半乳糖苷之间存在极显著正相关（P＜0.01），提示该4种黄酮类成分在桑寄生药材中的含量是相互促进的，某种成分含量高，其余成分也会协同升高。槲皮素与槲皮苷情况一致；异槲皮苷与槲皮苷、槲皮素呈显著负相关（P＜0.05），与槲皮素3-O-葡萄糖酸苷、芦丁呈极显著负相关（P＜0.01），且与其他黄酮类成分多呈不显著的负相关（P＞0.05）。含量最高的槲皮素3-O-葡萄糖酸苷与芦丁呈极显著正相关（P＜0.01），与异槲皮苷呈极显著负相关（P＜0.01），与槲皮素-3-O-（6"-没食子酰基）-β-D-葡萄糖苷呈显著负相关（P＜0.05），与其他黄酮类成分均有一定的正相关或负相关，但相关程度均不显著（P＞0.05）。同时，不同类别的成分之间也存在一定的相关性，如儿茶素与没食子酸、绿原酸、阿魏酸具有极显著正相关（P＜0.01）。原儿茶酸与金丝桃苷呈显著正相关（P＜0.05），与异槲皮苷、异樱花素呈极显著正相关（P＜0.01），与其他黄酮类成分呈现不同程度的负相关，其中，与芦丁、槲皮苷、槲皮素呈极显著负相关（P＜0.01），这表明当原儿茶酸的含量升高，桑寄生中芦丁、槲皮苷、槲皮素的含量会下降，具体原因有待进一步探讨。

图4 33种成分的相关性热图Fig.4 Heat map of correlation between 33 constituents*P ＜0.05；**P ＜0.011-33 were the same as those in Table 4

2.6.2 独立样本t 检验为更好地比较桑寄生茎枝和叶中各成分含量的差异，通过SPSS 21.0 对表7数据进行独立样本t检验。结果表明，黄酮类成分中，在不同样本茎枝和叶中含量较高的槲皮素3-O-葡萄糖酸苷、金丝桃苷、芦丁、异槲皮苷、槲皮苷具有极显著差异（P＜0.01），含量极低的扁蓄苷在茎枝、叶中也表现出极显著差异（P＜0.01）；氨基酸成分中，除含量较高的成分谷氨酸外，异亮氨酸、亮氨酸及苯丙氨酸也在茎枝和叶之间达到显著差异水平（P＜0.05），其他氨基酸间的差异不显著（P＞0.05）；核苷类成分中，含量最高的腺苷及含量较高的肌苷与鸟苷在茎枝和叶之间的差异均达到显著水平（P＜0.05），另2 种核苷的含量无显著差异（P＞0.05）。实验所测4 种有机酸的含量在茎枝、叶中均无显著差异（P＞0.05）。结果表明，槲皮素3-O-葡萄糖酸苷、金丝桃苷、芦丁、异槲皮苷、槲皮苷、扁蓄苷在不同部位的含量分布顺序为叶＞茎枝，不同部位中各成分的含量差异有统计学意义；而谷氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、腺苷、肌苷与鸟苷的含量也在桑寄生茎枝和叶中具有显著差异。这表明桑寄生采收时应注意保留有效成分含量高的叶，在干燥、包装和运输过程中减少掉叶，并对桑寄生药材的整个生产加工过程进行更规范、严格的管理，以保证药材质量。

3 结论

本文建立了超快速液相色谱-三重四极杆-线性离子阱质谱同时测定桑寄生中黄酮类、有机酸类、氨基酸类及核苷类共33种活性成分含量的方法，对供试品制备方法及色谱-质谱条件进行了优化，并通过相关性分析及独立样本t检验对桑寄生中33 种成分含量的变化关系及其在茎枝、叶中的含量差异进行比较。实验结果为揭示桑寄生茎枝和叶中多元活性成分的分布规律及合理利用桑寄生资源提供了基础资料，同时为桑寄生药材内在质量的综合评价和全面控制提供了新的参考方法。