分散固相萃取/超高效液相色谱-串联质谱法测定药用狗牙花中6种生物碱

樊轻亚，白泽方，汪学猛，王万好

（1.信阳职业技术学院，河南 信阳 464000；2.河南同源制药有限公司，河南 信阳 464000）

药用狗牙花是我国特有的夹竹桃科狗牙花植物，主要分布于我国南部各省，具有清热解毒、降压、消肿止痛之功效，临床可用于高血压、咽喉肿痛、风湿痹痛、肿瘤等疾病的治疗［1］。该植物主要含有生物碱和黄酮类化合物，研究者从药用狗牙花中提取得到了吲哚类生物碱［2-4］，其中冠狗牙花碱、伊波加明、伊波加因、伏康京碱、山辣椒碱、老刺木碱等是含量较多的成分。这些生物碱成分在戒毒、抗肿瘤、降血压、抗病毒等方面具有较好的药理活性［5-7］。

生物碱的分离纯化方法多为液液萃取法和固相萃取法等，传统的液液萃取法具有操作繁琐、有机溶剂用量大、残留多、成本高和污染环境等缺点。分散固相萃取法和固相萃取法的原理相似，均是利用目标检测物与杂质的极性不同，选取与杂质极性相近的吸附剂从提取试剂中直接去除杂质，从而达到富集和净化样品的效果。但传统固相萃取法的操作步骤复杂且时间长，溶剂消耗量大，不利于大批量样品的快速分析；且固相萃取小柱种类多，难以选择一种合适的固相萃取小柱。而分散固相萃取法利用少量吸附剂加入到提取液中吸附杂质，具有操作简单、萃取时间短、选择性高、重现性好、回收率高等优点，且有机溶剂消耗少、净化过程无需额外的有机试剂，成本低，绿色环保，在食品、医药化工等农药残留及痕量检测领域得到了越来越广泛的应用［8-12］。目前，分散固相萃取用于中草药有效成分分离纯化方面的研究也有报道，但在药用狗牙花萃取分离方面的应用国内外尚未见报道。

超高效液相色谱-串联质谱技术（UPLC-MS/MS）最早于1996 年问世，与传统高效液相色谱（HPLC）法相比，具有速度快、灵敏度高、分离效果好等优点，在食品、医药等领域具有广泛应用［14-17］。本文采用PSA 和NH2混合吸附剂净化样品，并与UPLC-MS/MS 联用测定狗牙花中6 种生物碱的含量。该方法简单快速、净化效果好、选择性好，灵敏度和精密度高，可快速检测狗牙花中6 种生物碱的含量，为狗牙花的进一步开发利用提供了研究基础。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

美国Waters Xevo TQ-MS 型超高效液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子源；冠狗牙花碱、伊波加明、伊波加因、伏康京碱、山辣椒碱、老刺木碱标准品（纯度＞98%，成都普菲德生物技术有限公司）；C18、N-丙基乙二胺（PSA）、NH2、N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯共聚物固相柱（HLB）、SCX、PCX 吸附剂（上海宸乔生物科技有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，德国默克公司）。实验用狗牙花药材均购于网络药材市场，经鉴定为药用狗牙花（Ervatamia officinalis Tsiang）。

1.2 实验方法

1.2.1 样品提取称取一定量过100目筛的狗牙花样品于50 mL离心管中，按固液比（g∶mL）1∶20加入一定量的1%氨水甲醇溶液，40 ℃水浴超声15 min，4000 r/min 离心10 min，吸取上清液，重复2 次，合并上清液，浓缩。移取上层清液氮吹浓缩至近干，加入5 mL甲醇，涡旋1 min复溶，备用。

1.2.2 分散固相萃取净化将上述复溶液转移至10 mL 离心管中，加入200 mg PSA 和200 mg NH2吸附剂，涡旋2 min，4000 r/min 离心5 min，过滤，氮吹浓缩至干，用UPLC 流动相进行溶解后，待测定。

1.2.3 对照品溶液的制备精密称取6 种对照品（冠狗牙花碱、伊波加明、伊波加因、山辣椒碱、老刺木碱、伏康京碱）各10.0 mg，分别用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成1 mg/mL的储备液。精密吸取6种储备液各1 mL，用甲醇定容至10 mL容量瓶中，即得0.1 mg/mL的混合对照品溶液。

1.3 样品分析条件

1.3.1 色谱条件色谱柱：ACQUITY UPLC BHE C18（50 mm × 2.1 mm，1.7 µm，美国Waters 公司）；流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸铵（B），梯度洗脱程序：0～3 min，2%～10%A；3～10 min，10%～50%A；10～17 min，50%～85%A；17～20 min，85%～2%A；柱温：30 ℃；流速：0.3 mL/min；进样量：3µL。

1.3.2 质谱条件离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子模式；离子源温度：130 ℃；干燥气温度：350 ℃；干燥气（N2）流速：9.0 L/min；毛细管电压：3.0 kV；锥孔气流量：50 L/h；碰撞气流量：2.5 L/h。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

中药材中有效成分提取是基于各种成分在有机溶剂中的溶解性能差异，因此提取溶剂对各待测物的提取率有较大影响。本实验分别选择水、甲醇、乙醇、乙腈、1%氨水甲醇作为提取溶剂，考察了不同溶剂对6种生物碱提取率的影响，结果见图1。

由图1 可知，上述5 种提取溶剂对狗牙花的提取率相差较大，在水和乙醇中的提取效果相对不佳，且水和乙醇提取的色素、脂肪等非极性干扰物较多，不利于后续净化。甲醇和乙腈的提取率较优，由于乙腈价格高于甲醇，选择甲醇作为提取溶剂。进一步在甲醇中加入一定比例的氨水，结果显示，由于狗牙花中生物碱在植物细胞中大部分以盐的形态存在，加入氨水使得生物碱游离为分子状态，能有效抑制分析物发生离子化反应，从而增加分析物在有机相中的分配比例，因此1%氨水甲醇比纯甲醇的提取效率更高。且1%氨水甲醇提取后的色谱图中杂质较少，基线和峰形好，所以选择1%氨水甲醇作为提取溶剂。

图1 不同提取溶剂对6种生物碱提取率的影响Fig.1 Effect of different solvents on the yields of six alkaloids

提取溶剂的用量对提取效率亦有较大影响，本实验选择最佳提取溶剂，进一步考察了待测样品用量与溶剂用量的固液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）对6 种生物碱提取率的影响。结果显示，固液比在1∶10以下时的提取率较低，这是由于提取溶剂用量较少时，待测物浓度较大，不能很好地提取出各待测物，且会造成较强的基质抑制效应。随着固液比的增加，待测物的提取率逐渐增加，当固液比超过1∶20时，提取率增加不多，且溶剂过多会增加氮吹时间，因此选择固液比为1∶20。

2.2 吸附剂的选择

狗牙花中黄酮类、脂类、糖类等成分会干扰待测物的分析，而且会损坏检测仪器和色谱柱。实验考察了C18、PSA、NH2、HLB、SCX、PCX 6 种吸附剂对6 种生物碱回收率的影响（见图2）。由图2 可知，弱阳离子吸附剂HLB、C18的净化回收率一般，这是由于C18吸附剂具有疏水作用，对非极性的组分有吸附；HLB 吸附剂是一类用于酸性、中性和碱性化合物的通用型吸附剂，对极性化合物具有较强的保留，因此对待测生物碱也有一定的吸附作用。SCX 柱和PCX 柱是利用聚合物填料合成的新型阳离子交换树脂，具有表面亲水和强阳离子交换特性，对生物碱的吸附较强，不利于净化。PSA 和NH2的净化效果较好，且对生物碱无吸附，这是由于PSA 吸附剂在硅胶上键合乙二胺-N-丙基官能团，主要作用力是弱阴离子交换作用，可与金属离子产生鳌合作用，有效去除脂肪酸、有机酸、极性色素及糖；NH2是由硅胶键合氨丙基，兼具极性吸附和弱阴离子交换作用，可通过弱阴离子交换或极性吸附达到保留作用。因此，选择PSA和NH2两种填料作为吸附剂。

图2 6种吸附剂对生物碱回收率的影响Fig.2 Effect of six adsorbents on the recovery of alkaloids

实验对NH2和PSA两种吸附剂的用量进行了优化。设计了5个质量水平，5 mL提取液中分别加入吸附剂的用量为50 mg NH2+ 50 mg PSA、100 mg NH2+ 100 mg PSA、150 mg NH2+ 150 mg PSA、200 mg NH2+200 mg PSA、250 mg NH2+250 mg PSA。结果表明，当吸附剂用量较低时，净化不完全，目标化合物的提取率较低。随着吸附剂用量的增加，生物碱的提取率增加，当吸附剂用量增至200 mg时，提取率达到最大，此后增加吸附剂的用量提取率反而降低。这是由于吸附剂用量过高时，会对目标化合物产生吸附，从而降低目标化合物的提取率。实验最终选择吸附剂的用量为200 mg PSA和200 mg NH2。

2.3 色谱-质谱条件的优化

2.3.1 色谱条件的优化对狗牙花经分散固相萃取后的提取液进行UPLC-MS/MS分析，考察了有机相溶剂（甲醇、乙腈）中加入不同种类的缓冲液（三乙胺、乙酸铵、甲酸铵、氨水等）作为流动相时对待测物分离效果和质谱电离的影响。结果表明，采用乙腈作为有机相的待测物峰形及响应值均优于甲醇。在有机相中添加甲酸铵可使质谱电离过程的离子化程度更高，质谱响应更强，且有利于改善色谱峰峰形。因此，本实验选择梯度洗脱方式，以乙腈-0.1%甲酸铵溶液为流动相，6种生物碱获得良好的分离度，峰形好、柱效高，可满足狗牙花中生物碱的快速分析要求。狗牙花经分散固相萃取后的总离子流色谱图见图3。

图3 狗牙花经分散固相萃取后的总离子流色谱图Fig.3 Chromatogram of extract from Ervatamia officinalis Tsiang by dispersive solid phase extraction1. coronaridine；2. ibogamine；3. ibogaine；4. voacangine；5. tabernaemontanine；6. vobasine

2.3.2 质谱条件的优化及裂解途径采集全扫描模式下正离子、负离子信号，结果显示负离子模式下几乎无质谱响应，因此选择响应良好的ESI（+）作为离子化模式，分别找出6 种化合物的［M+H］+，作为准分子离子峰。将母离子进行碰撞诱导产生子离子，进一步优化干燥气流速、碰撞电压和锥孔电压等参数，选择2 个响应较强的子离子作为监测碎片离子，选择响应值最大的子离子进行定量分析，6种化合物的质谱参数见表1。

表1 6种生物碱的质谱参数Table 1 MS parameters of 6 alkaloids

在ESI（+）-MS/MS 条件下，6 种化合物主要发生侧链断裂，根据质谱二级数据可推测其裂解途径。本文的6 种生物碱母核均有吲哚环，伊波加因和伏康京碱为10-位甲氧基取代的吲哚类生物碱，发生10-位甲氧基断裂，其他4 种生物碱为未取代的吲哚类生物碱；伊波加明和伊波加因的16位未被取代，冠狗牙花碱、山辣椒碱、老刺木碱、伏康京碱的16 位均有—COOCH3，均发生脱—COOCH3反应；6 种生物碱共同的质谱断裂特征为20位发生断裂，老刺木碱的20位脱去乙烯基，其它5种生物碱发生20位脱乙基反应。6种生物碱的质谱裂解途径见图4。

图4 6种生物碱的二级质谱图与质谱裂解途径Fig.4 MS/MS spectra and fragmentation pathways of 6 alkaloids

2.4 线性关系、检出限与定量下限

分别称取一定量的6 种生物碱标准溶液5 mL，配制成1、5、10、20、40、80、100 mg/L 系列标准工作溶液，按UPLC-MS/MS 条件进行测定，以待测物的色谱峰面积（Y）和对应质量浓度（X）绘制标准工作曲线，得出线性回归方程。分别以信噪比S/N=3 及S/N=10 计算该方法的检出限和定量下限。由表2 可知，6 种生物碱的线性范围均为1～100 mg/L，相关系数不低于0.9837，检出限为0.05～0.10 mg/L，定量下限为0.15～0.35 mg/L，表明本方法的灵敏度良好。

2.5 回收率与相对标准偏差

分别准确称取3 份样品，测得6 种生物碱的含量分别为冠狗牙花碱（690 µg/g）、伊波加明（302 µg/g）、伊波加因（268 µg/g）、伏康京碱（211 µg/g）、山辣椒碱（445 µg/g）、老刺木碱（395 µg/g）。分别添加1、10、50 mg/L 3 个质量浓度的6 种生物碱混合对照品溶液，采用本方法进行前处理和测定，平行测定6 次，结果见表2。6 种生物碱的加标回收率为93.2%～98.1%，相对标准偏差（RSD）为1.7%～2.9%，表明本方法的准确度和精密度良好。

表2 6种生物碱的线性关系、检出限、定量下限、加标回收率及相对标准偏差（n=6）Table 2 Linear relations，detection limits，quantitation limits，recoveries and RSDs of 6 alkaloids（n=6）

2.6 实际样品检测

在优化的萃取条件下，精密称取6 个产地狗牙花药材各10 g，按照本方法进行前处理和测定，并进行3个水平（1、10、50 mg/L）的加标回收实验，每个水平测定6次（见表3）。

表3 6个产地狗牙花中生物碱的分析结果（n=6）Table 3 Analytical results of 6 alkaloids in Ervatamia officinalis Tsiang from 6 place of origin（n=6）

由表3可知，6个产地的狗牙花中均检出6种生物碱，含量为0.07～0.86 mg/g，其中冠狗牙花碱的含量最高，伊波加明、伊波加因、伏康京碱在各产地中的含量相差较大；海南产地的6 种生物碱含量整体高于其它产地，而四川产地的6 种生物碱含量整体低于其他产地，这些含量和分布的差别可能与该植物生长时所需的温度与地质条件有关。因此在提取狗牙花中生物碱时，应根据其组成和含量分布进行产地筛选，以获得更高的提取率，降低生产成本。6 个产地狗牙花中6 种生物碱的加标回收率为91.5%～98.6%，RSD 为1.1%～2.9%，说明所建立方法具有良好的精密度和准确度，适用于不同产地狗牙花中6种生物碱的检测。

3 结论

本文将分散固相萃取技术应用于狗牙花中生物碱的萃取，采用单因素实验考察了各因素对6 种生物碱提取率的影响，并与超高效液相色谱-串联质谱法联用测定了狗牙花中6 种生物碱的含量。该方法前处理操作简单，净化效果好，灵敏快速，是一种具有发展前景的萃取技术，可为后继药物的研究和开发提供理论及数据支撑。