大小兴安岭森林土壤中两种芽孢杆菌对辣椒疫霉菌的拮抗作用

刘思佳，梁国爽，王宁，白龙，崔岱宗，赵敏

（东北林业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨 150040）

辣椒疫霉菌是引起辣椒疫病的病原体，最早报道于美国新墨西哥州[1]。它具有广泛的宿主谱，包括茄科、葫芦科和豆科等，可以引起多种重要的植物病害[2-6]。我国最早于20 世纪60 年代在江苏省报道，在接下来的20～30 年间传播至种植辣椒的各个省份，对我国的辣椒种植产业造成了巨大的经济损失[7-11]。

目前，防治辣椒疫病的主要方法是使用化学合成的杀菌剂，但长期使用单一药剂很可能产生耐药菌株，使耐药问题更加严重[12]，且产生环境污染等问题[13]。而生物防治方法防治效果好，不易产生病虫害防治抗体。使用生物防治技术的微生物可促进健康的植物组织生长、提高植物抗性、控制植物病害发展、修复土壤生态系统[14-16]。辣椒疫病的生物防治主要是利用微生物来抑制或直接杀死辣椒疫霉菌的生长，达到防控辣椒疫病的目的[17]。关于生物防治辣椒疫病的方法及其防效测定已有报道[18-20]，其中，芽孢杆菌由于具有培养条件简单、抗逆性强、抗菌活性物质产量相对较高等优势已成为生物防治辣椒疫病的重要材料[21]。蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌在自然界分布广泛，枯草芽孢杆菌已在防治植物病害菌剂中普遍应用[22]，蜡样芽孢杆菌对松材线虫与番茄根结线虫具有明显的预防效果[23-24]，但在防治辣椒疫病方面报道较少。

本试验以东北大小兴安岭菌物资源调查项目为依托，选用枯草芽孢杆菌T-BH-4、蜡样芽孢杆菌5-HH-6进行辣椒疫霉菌拮抗作用的初步探究，为二者在防治辣椒疫病方面奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.2 培养基。燕麦固体培养基（OMA）：25g 市售生燕麦加入蒸馏水煮沸30min，纱布过滤后补加蒸馏水定容至1L，加入15g 琼脂粉摇匀，高压灭菌备用。

营养肉汤（NB）：18g 营养肉汤NB 粉溶解到1L 蒸馏水中，高压灭菌备用。V8 培养基（V8）：100 mL 美国进口V8 蔬菜汁，加入2g 碳酸钙混匀后煮沸，补加蒸馏水定容至1L，高压灭菌备用[25]。

1.1.3 试剂。丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量试剂盒，苏州格锐思生物科技有限公司生产。

1.2 无菌发酵液和孢子悬浮液的制备

1.2.1 拮抗菌无菌发酵液的制备。取活化的拮抗菌单菌落接种至200mL 营养肉汤中，37℃振荡培养24h 得到拮抗菌原液，离心除去菌体。上清液经0.22μm 细菌过滤器过滤得到无菌发酵液，4℃保存备用。

1.2.2 辣椒疫霉菌孢子悬浮液的制备。活化7d 后的辣椒疫霉菌，用打孔器打取直径7 mm 的菌饼放置在培养皿上，每皿20 个菌饼，倒入20mL V8 培养基，28℃下培养3d。将培养皿中培养基抽出，加入20mL 无菌水，12h 后置于4℃冰箱中30～40min，室温静置1h，血球计数板计数并调整游动孢子悬浮液浓度至1×106cfu/mL，备用。

1.3 拮抗菌粗提物对辣椒疫霉菌生长和代谢的影响

1.3.1 对菌丝生长的作用。融化的15mL 燕麦固体培养基加入5 mL 无菌发酵液混合均匀倒平板，在平板中央接种辣椒疫霉菌菌饼，28℃培养，十字交叉法测量第4～11d 的菌落直径，重复3 次，计算抑菌率。将无菌发酵液替换为营养肉汤作为对照。

1.3.2 对孢子囊形成的作用。取10 片菌饼置于无菌培养皿，每个培养皿分别加10mL 浓度为25%、50%、75%、100%的无菌发酵液，28℃光照48 h，吸取15 μL 液体于载玻片，显微镜观察并记录孢子囊的产生情况，取4个视野，重复3 次，计算孢子囊形成的抑制率。将无菌发酵液替换为无菌水作为对照。孢子囊形成抑制率（%）=（对照组孢子囊形成数-处理组孢子囊形成数/对照组孢子囊形成数）×100。

1.3.3 对游动孢子萌发的作用。取5mL 游动孢子悬浮液与1mL 无菌发酵液均匀混合，28℃下培养8h、16h、24h后显微镜观察游动孢子萌发个数，以芽管长度超过孢子直径一半作为萌发标准，取5 个视野，每个视野观察30～40 个游动孢子萌发情况，重复3 次，计算游动孢子的萌发率和抑制率。游动孢子萌发率（%）＝（游动孢子萌发数／观察游动孢子总数）×100；游动孢子萌发抑制率（%）=（对照组游动孢子萌发数-处理组游动孢子萌发数）/对照组游动孢子萌发数×100。

1.3.4 对MDA 含量的测定。取1.3.2 中25%浓度无菌发酵液处理组以及对照组中的菌饼，使用MDA 含量试剂盒测定辣椒疫霉菌的MDA 含量，重复3 次。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌粗提物对辣椒疫霉菌菌丝生长的影响

图1 是枯草芽孢杆菌对辣椒疫霉菌的抑制情况，图中线段表示十字交叉法测得的菌丝直径。图2 是2 种菌对辣椒疫霉菌菌丝生长的抑制率，枯草芽孢杆菌在接种4～14d 阶段中对辣椒疫霉菌的抑制率在10%～20%，在接种4d 时抑制率最高，达19.11%；第11d 时抑制率最低，为11.06%。蜡样芽孢杆菌在接种4～14d 阶段中对辣椒疫霉菌的抑制率趋势逐渐降低，在接种4d 时抑制率最高，达49.79%；第12d 时抑制率最低，为23.01%。总体来看，蜡样芽孢杆菌对辣椒疫霉菌菌丝抑制效果好于枯草芽孢杆菌。

图1 接种4 d 后拮抗菌粗提物对辣椒疫霉菌菌丝生长的抑制（a，培养基含有B.subtilis 无菌发酵液；b，培养基含有B.cereus 无菌发酵液；c，培养基含有营养肉汤。）

图2 拮抗菌粗提物对辣椒疫霉菌菌丝生长的抑制率

2.2 拮抗菌粗提物对辣椒疫霉菌游动孢子囊形成的影响

由图3 可知，光照培养48 h 后，由各组孢子成囊数计算可得：枯草芽孢杆菌与蜡样芽孢杆菌的无菌发酵液在100%浓度下抑制率分别为98.48%与95.45%，在75%浓度下分别为78.79%与93.94%，在50%浓度下分别为78.79%与87.88%，在25%浓度下分别为66.67%与78.79%。本试验结果中，75%、50%、25%浓度的蜡样芽孢杆菌无菌发酵液对辣椒疫霉菌游动孢子囊形成的抑制程度均高于等浓度的枯草芽孢杆菌无菌发酵液。

图3 拮抗菌粗提物对辣椒疫霉菌游动孢子囊形成的影响

2.3 拮抗菌粗提物对辣椒疫霉菌游动孢子萌发的影响

由图4 可知，在培养8h 后，枯草芽孢杆菌与蜡样芽孢杆菌无菌发酵液处理后的辣椒疫霉菌游动孢子萌发率分别为16.52%、15.32%，二者对于辣椒疫霉游动孢子萌发抑制率分别为27.88%、33.14%；培养16h 后，萌发率分别为12.59%、11.77%，抑制率分别为74.18%、72.29%；培养24h 后，萌发率分别为16.65%、21.07%，抑制率分别为61.17%、50.85%。试验结果表明，培养16h、24h 时2 种芽孢杆菌均对辣椒疫霉菌游动孢子萌发有明显抑制效果，培养16h 后在两种芽孢杆菌的作用下，辣椒疫霉菌游动孢子均达到最低萌发率与最高抑制率。

图4 拮抗菌粗提物在培养不同时间对辣椒疫霉菌游动孢子萌发率的影响

2.4 拮抗菌粗提物对辣椒疫霉菌MDA 含量的影响

由表1 可知，枯草芽孢杆菌无菌发酵液处理过的辣椒疫霉菌MDA 含量高于对照组66.70%，蜡样芽孢杆菌无菌发酵液处理过的辣椒疫霉菌MDA 含量高于对照组151.66%，即蜡样芽孢杆菌对辣椒疫霉菌细胞膜破坏更严重。

表1 拮抗菌粗提物对辣椒疫霉菌MDA 含量的影响

3 讨论

3.1 菌粗提液对辣椒疫霉菌菌丝生长的抑制效果

菌丝在病原菌生长过程中，起到固定菌落、吸收养分等作用，并在成熟到一定程度时可产生孢子。抑制病原菌菌丝生长速度是防治病原菌过程中的重要一步。试验结果表明，虽然在后期蜡样芽孢杆菌对辣椒疫霉菌菌丝生长的抑制趋势逐渐降低，但抑制效果仍高于枯草芽孢杆菌。枯草芽孢杆菌对辣椒疫霉菌的抑制率发展趋势与以往研究结果[26]一致，在与枯草芽孢杆菌相同培养条件下，蜡样芽孢杆菌显示出了更加优异的抑制作用。

3.2 菌粗提液对辣椒疫霉菌孢子囊形成与游动孢子萌发的抑制效果

抑制病原菌的孢子囊形成，对后续游动孢子释放、萌发及侵染具有重要的影响作用。本试验结果中，75%、50%、25%浓度的蜡样芽孢杆菌无菌发酵液对辣椒疫霉菌游动孢子囊形成的抑制程度均高于同等浓度的枯草芽孢杆菌无菌发酵液。在应用蜡样芽孢杆菌防治辣椒疫霉菌的过程中，可以从抑制游动孢子成囊方面作为实际生产应用的切入点进行防治。

抑制病原菌游动孢子萌发对减少病原菌的扩散范围等方面具有重要意义。本试验结果中，2 种芽孢杆菌均对辣椒疫霉菌游动孢子萌发有明显抑制效果，但二者之间的抑制效果差异不显著，说明在抑制辣椒疫霉菌游动孢子萌发方面，2 种芽孢杆菌对其作用力相对一致。

3.3 菌粗提液对辣椒疫霉菌MDA 含量的影响

MDA 是微生物在逆境条件下发生膜脂过氧化的重要产物之一，能反映细胞膜的过氧化程度和微生物抗逆能力[27]。本试验结果中，由于蜡样芽孢杆菌促使辣椒疫霉菌释放MDA 更多，而MDA 具有细胞毒性更易加剧细胞膜损伤，说明辣椒疫霉菌对蜡样芽孢杆菌的抗性更弱。

4 结论

本研究数据表明，枯草芽孢杆菌T-BH-4 与蜡样芽孢杆菌5-HH-6 分均在抑制辣椒疫霉菌菌丝生长、游动孢子成囊和萌发方面有较强的抑制作用，二者也对辣椒疫霉菌细胞膜有着不同程度的伤害。而在抑制辣椒疫霉菌菌丝生长和游动孢子成囊方面，蜡样芽孢杆菌5-HH-6 更为适合。本试验结果为农业生产上抑制辣椒疫霉菌提供了新的思路，应得到更加深入的研究、发挥与利用。