菊花“粉十八”组织培养技术研究

武颖

（德州市城市园林规划设计研究院，山东德州 253000）

菊花属菊科多年生宿根草本植物，是我国四大传统名花（牡丹、菊花、山茶、水仙）之一，也是花中“四君子”（梅、兰、竹、菊）之一，自古以来就深受国人喜爱。我国有重阳节赏菊花、饮菊花酒的习俗，菊花栽培种植历史悠久，品种资源丰富，文化内涵深远，具有较强的观赏价值和经济价值。菊花传统繁殖方式多采用扦插繁殖和分株繁殖，繁殖周期长，受季节限制较大。近年来，随着植物组织培养技术的快速发展，因其在产业化生产、品种脱毒等方面的优势，也成为菊花新优品种、名贵稀有品种繁殖的重要途径。菊花品种“粉十八”花瓣面为玫粉红色，背粉白色，平瓣，瓣面上玫粉红色间有白色晕斑或红白晕染，瓣根多为白色。筒状花发达，露心，花姿艳丽，犹如一名翩翩起舞的少女，极具观赏价值，适合家庭盆栽养殖。本研究以“粉十八”茎尖、茎段为外植体，对其进行离体组织培养研究。

1 菊花组织培养概念和优势

1.1 菊花组织培养的概念

菊花组织培养技术，是指选取菊花茎段、茎尖、叶片、花蕾、花药等作为外植体，消毒处理后接种于人工配制、添加不同激素的培养基上进行诱导，建立无菌体系，使其再生形成完整植株的技术方法。该技术依赖于植物细胞的全能性，通过组织培养可以得到完整的菊花植株。

1.2 菊花组织培养的优势

菊花的繁殖方法较多，传统方法多采用扦插繁殖和分株繁殖，传统繁殖需要大量母本植株，周期长，受季节和环境限制大。另外，菊花病毒病种类多，使用携带病毒的母本进行扦插，会引起病毒病的扩张和蔓延，从而导致幼苗质量差，优良品种长此以往会发生退化现象。采用菊花组培技术，繁殖系数高、生长周期短，可在短时间内繁殖出大量生长一致的组培苗，还可进行品种的脱毒、复壮、种质资源保存，保持品种特性。培养条件既可人为控制，管理方便，又可摆脱自然地理环境和季节的限制，有利于工厂化生产和自动化控制等。利用组织培养技术，还能解决因长期采用扦插和分株繁殖导致的种性退化、产量下降等问题。

2 材料与方法

2.1 试验材料

采用锦绣川景区菊花养殖基地春季新生长出的“粉十八”嫩茎作为外植体进行试验，属于植物器官培养。春季是植物生长发育的黄金季节，取幼龄生长健壮的外植体更容易诱导成功。在晴朗天气采集可减小外植体消毒难度，最大程度减少外植体污染，有利于建立无菌体系，外植体采集后应尽快处理，放置过久生物活性会下降。从植物体上切割分离下来用以无菌培养的部分称为外植体，外植体是用于组培快繁的初代接种材料，包括植物细胞、器官、组织或原生质体[1]。外植体的选择是组织培养试验重要的基础性环节，对建立无菌体系及能否成功诱导出愈伤组织或不定芽起着重要作用。选择时需考虑植物品种、年龄及生长状态等多方面因素，通常选用易于消毒、代谢旺盛、有较强再生能力的组织或器官作为外植体[2]。

2.2 试验方法与设计

2.2.1 不同灭菌处理对外植体的影响。将采集到的“粉十八”顶端幼嫩茎段于清水冲洗30min，剪去叶片，放置于超净工作台，用70%～75%的酒精消毒10s。酒精穿透力强，对植物细胞具有较大杀伤力，幼嫩的植物器官应合理控制消毒时间，消毒后立即放入灭菌剂进一步消毒。0.1%升汞溶液，分别处理3min、5min、8min；2%次氯酸钠溶液，分别处理8min、10min、15min；10%次氯酸钠溶液，分别处理5min、7min、10min。为使灭菌剂更好地浸润外植体，在灭菌剂中添加几滴0.1%吐温-80，消毒期间轻轻晃动盛放消毒液和外植体的器皿，使消毒液与植物材料充分接触。

2.2.2 接种。外植体经过处理后，在无菌条件下放置于培养基上的过程称为接种。外植体消毒处理后，用无菌水冲洗4～6 次，直至无菌水中不见泡沫。无菌滤纸吸干水分后切成1cm 的茎尖和茎段，用消毒后的镊子夹住，垂直插入启动培养基，茎段至少应携带1 个茎节，接种时插入深度不可淹没茎节。每个培养瓶最好只接1 个外植体，最多不超过3 个，避免相互污染。接种操作在超净工作台进行，外植体消毒后应立即接种于启动培养基，如若不能马上接种，应浸润于无菌水中，时间不宜过长。

2.2.3 不同激素浓度对外植体初代启动的影响。将“粉十八”外植体切成1～1.5cm 带芽茎段，接种于启动培养基，外植体不宜过大。启动培养基中添加6-BA（浓度分别 为2.0mg/L、1.0mg/L、0.5mg/L）、NAA（浓度分别为0.3mg/L、0.2mg/L、0.1mg/L）2 种激素，共9 种培养基。每种培养基接种30 个外植体，重复3 次，通过试验观察不同激素浓度和配比诱导外植体的效果。

2.2.4 不同激素浓度对继代培养的影响。“粉十八”茎段启动培养后得到无菌侧芽，但数量有限，需转移到新的培养基上继续培养，获得大量丛生芽，即继代培养，将启动培养得到的丛生芽切割成单个转接于继代培养基。无菌材料在适宜的环境和营养条件下，可通过调节激素浓度和不同类型激素的相对配比，人为控制增殖系数。继代培养基中添加不同浓度和配比的6-BA（浓度分别为2.0mg/L、1.0mg/L、0.5mg/L）和NAA（浓度分别为0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L）2 种激素，共9 种培养基，每种培养基接种30 个无菌芽，重复3 次，观察记录其增殖效果。

2.2.5 不同激素浓度对生根培养的影响。继代培养得到的丛生芽，转接于生根培养诱导生根。菊花容易生根，采用1/2 MS+NAA 0.02mg/L、1/2 MS+NAA 0.2mg/L 及不添加任何激素的MS 培养基3 种生根培养基，剪切生长健壮的丛生芽于生根培养基，7d 后观察其生根情况。

2.2.6 培养条件。试验获得的无菌瓶苗放置于无菌培养室进行培养，无菌培养室温度23～28℃，室内相对湿度70%～80%，人工补光，光照2000Lux，每天光照14h。

2.2.7 生根苗移栽。生根培养2 周后，挑选健壮的无菌苗进行移栽，根系长度不宜太长，以不在培养基中弯曲为宜。因无菌培养室与大田环境存在较大差异，为保证无菌苗在大田环境能够正常成活并生长，移栽前需炼苗。先在栽培场所封口炼苗7d，开盖继续炼苗3d，最后用镊子小心夹出生根苗，清洗根部培养基后，种植于添加种植基质的穴盘，放置20～30d，温室15～35℃，相对湿度达70%以上，待其成活并正常生长后定植于大田，正常养护。

3 结果与分析

3.1 不同灭菌剂浓度和灭菌时间对外植体消毒的影响

外植体消毒所使用的灭菌剂，既要起到灭菌作用，又不能伤害植物活性。由表1 可知，经0.1%升汞溶液处理的“粉十八”茎尖全部失活；茎段经升汞溶液处理5min、8min 后，均失去活性；茎段用0.1%升汞溶液处理3min 后，污染率为40%，浪费严重，达不到最佳灭菌效果。此外，升汞属于剧毒药剂，残留不易去除，对外植体活性具有杀伤力，且会对环境造成严重伤害。因此，本试验采用的幼嫩茎尖、茎段不宜采用升汞作灭菌剂处理。

表1 0.1%升汞溶液处理“粉十八”外植体污染率

由表2 可知，2%次氯酸钠对外植体活性杀伤力较小，但污染率高。处理外植体8min 污染率为100%；处理茎尖、茎段10min 外植体污染率分别为86.6%、80%；处理茎尖、茎段15min 外植体污染率分别为63.6%、50%。

表2 2%次氯酸钠溶液处理“粉十八”外植体污染率

次氯酸钠消毒液对外植体杀伤力小，残留少，适宜的浓度和时间也能起到良好的灭菌作用。由表3 可知，用10%次氯酸钠溶液处理茎段10min，污染率仅为6.7%。综合考虑，茎段经酒精短暂处理后，用10%次氯酸钠溶液消毒10min，是最佳的外植体消毒方法。

表3 10%次氯酸钠溶液处理“粉十八”外植体污染率

3.2 不同激素浓度对外植体初代启动的影响

外植体接种于启动培养基后，基部膨大形成愈伤组织，腋芽在激素的刺激下萌发，愈伤组织继续培养可长出绿色丛芽。由表4 可知，启动培养基中NAA 浓度超过0.2mg/L 时，外植体基部分化出较多愈伤组织，但芽诱导率低，无法诱导出健壮侧芽。当NAA 浓度为0.1mg/L，诱导出的侧芽长势健壮，生长速度快。但高浓度的6-BA会导致玻璃化，6-BA 浓度为2.0mg/L 时，普遍存在玻璃化现象。当培养基中激素浓度为 MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L 时，平均芽诱导率达到100%，且芽壮，颜色呈深绿色，生长速度快，适合作为“粉十八”启动培养基。

表4 不同激素浓度对外植体启动培养的影响

3.3 不同激素浓度对继代培养的影响

由表5 可知，当增殖培养基为MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L 和 MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L 时，增殖系数分别为5.83、4.2，转接后的无菌芽2 周后长出深绿色、健壮的丛生芽，4 周后即可达到重复转接或生根水平。当培养基中6-BA 浓度为1.0mg/L 时，叶片卷曲、生长缓慢，6-BA 浓度为2.0mg/L 时，叶片畸形，玻璃化现象较重。由此可知，6-BA 虽然可以促进芽的形成、侧芽的生长，但浓度过高不利于植物正常生长。如果生长素比例大，则不定芽生长健壮，而增殖系数较低，达不到快速繁殖的目的。如果只用细胞分裂素，植株增殖系数虽大，但组培苗较细弱，需加入生长素以促进茎生长，需要一个壮苗的过程[3]。只有将二者比例调整到适宜水平，才能使健壮的不定芽快速增殖。

表5 不同激素浓度对继代培养的影响

3.4 不同激素浓度对生根培养的影响

根据试验，生根培养基为 1/2MS+NAA 0.02mg/L，1/2MS+NAA 0.2mg/L 时，7d 后无菌瓶苗均长出1cm 的白色不定根，且瓶苗颜色深绿，长高趋势明显，茎部长粗，叶片更加肥厚，适宜作为“粉十八”无菌瓶苗生根诱导的培养基。菊花易生根，空白MS 培养基作为生根培养基也可长出根系。在空白培养基培养10d 开始长出白色不定根，但生长速度缓慢，无法达到壮苗目的。

3.5 移栽大田后成活率

生根苗经驯化后定植于大田，小苗生长健壮，叶色深绿，成活率可达95%。

4 结语

“粉十八”是菊花十八系列之一，花瓣少，基部白色筒状，花瓣自基部延伸开展变大，黄色花心外露，花为奶白色，上面有淡紫红色条纹或色晕，花瓣呈辐射状略下垂，花姿奇特优美，极具观赏价值。由于分枝较少，无法为扦插繁殖提供大量母本，因而繁殖成活率低。本研究采用组织培养的方式，在MS 培养基中添加6-BA、NAA 2 种激素，探索不同激素浓度和配比，对诱导侧芽、大量分化丛生芽的效果，并诱导生根、移栽驯化，试图通过组培打破季节限制，短时间内得到大量生长一致的幼苗。

试验成功的关键在于激素的浓度和配比，启动培养阶段的NAA 浓度过高，会诱导产生大量愈伤组织，但愈伤组织包裹住原有外植体，无法分化形成不定芽；而6-BA 浓度过高，又会引起玻璃化，不利于转接后的增殖。试验结果表明，启动阶段MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L 时，可诱导腋芽萌发，获得健壮的无菌芽，为后续继代培养提供无菌体系。

继代培养时，6-BA 浓度应比启动培养基低，有利于诱导形成大量丛生芽。6-BA 浓度过高既会引起玻璃化现象，又会导致叶片卷曲，甚至出现畸形，植株生长缓慢。试验发现，继代培养基中，激素浓度为启动培养基的一半时，可取得较好的诱导丛芽效果，即培养基为MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L 时，可诱导出健壮的丛芽，增殖系数也能满足生产需求。菊花易生根，为实现生根和壮苗双重效果，生根培养基可采用1/2MS+NAA 0.02mg/L，7d 左右就可诱导长出白色根系，且移栽后成活率高。