Calretinin、S100免疫组化染色诊断先天性巨结肠的价值△

张云鹤 张君娜

(河南大学第一附属医院病理科 开封 475000)

先天性巨结肠(HD)好发于婴幼儿，主要是由复杂的基因紊乱所致，患儿以顽固性便秘腹胀和巨结肠伴发小肠结肠炎为主要表现，并伴有不同程度的营养不良症状，严重影响婴幼儿的生长发育[1]。但经研究发现[2]，在临床表现上，HD与其他肠神经系统异常疾病具有较高的相似性，因此为避免误诊和漏诊现象的发生，延误患儿的治疗，精确的诊断必不可少。目前，临床对HD诊断的金标准是依靠发现肠组织肌层或黏膜下层的神经丛内是否缺乏神经节细胞，同时在黏膜下层是否存在神经纤维的增生，正因如此，病理科医师多采用乙酰胆碱酯酶染色的方式寻找黏膜下神经纤维来为诊断提供依据，但该方式耗时较长、操作步骤相对较为繁琐，因此急需寻找快速准确的诊断方式[3]。对比本研究选取127例疑似HD患儿展开研究，采用S100免疫组化染色和Calretinin检测，观察两种方式单独检测和联合检测的诊断价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年5月-2020年12月本院收治的127例疑似HD患儿为研究样本，所有患儿均存在不明原因的腹胀和便秘症状，同时排除功能性便秘和代谢性紊乱症状，所有患儿家长均已知晓本研究目的和潜在的风险，自愿参与本项研究。127例疑似HD患儿中男75例，女52例，出生日龄2～27d，平均出生日龄(18.56±2.33)d。

1.2 方法

分别于患儿病变肠段近端扩张段和远端狭窄段进行取材，免疫组化染色的具体步骤：石蜡包埋、脱腊，逐渐进行水化，采用EDTA抗原进行修复，再选用过氧化氢进行清除，一抗、二抗孵育后DAB显色。采用苏木素复染，选取盐水乙醇反蓝，最后在进行脱水封片。由两位病理科资深医师在显微镜的分别进行读片，观察神经纤维和神经节细胞染色情况。其中Calretinin染色特点是可在肠组织的黏膜层和固有层发现呈棕黄色细丝状的神经纤维，黏膜下层可见棕黄色的粗神经纤维和棕黄色颗粒团状的神经节细胞，但在缺失的神经节细胞中则不染色。而S100免疫组化染色特点则是在肠组织黏膜下层可见呈棕黄色染色的神经纤维 和神经胶质细胞，神经纤维之间的神经节细胞呈空泡状、无染色；而缺失神经节细胞的肠组织无空泡状表现，但可见强阳性染色的粗神经纤维。

1.3 观察指标

Calretinin染色检查以黏膜下层可见神经节细胞Calretinin染色为阳性，S100免疫组化染色以存在增粗神经纤维S100染色为阳性，而乙酰胆碱酯酶染色结果显示镜下黏膜肌层可见较多的乙酰胆碱酯酶染色信号为阳性；相反则均为阴性。以乙酰胆碱酯酶染色结果为金标准，对比Calretinin和S100免疫组化染色检查单独以及联合检测在新生儿HD中的诊断效能[4]。同时观察两种染色方式联合检测在HD扩张段和狭窄段的检出情况，对比其与金标准的一致性和符合率。

1.4 统计学方法

采用SPSS23.0统计学软件进行数据分析，计数资料(阳性检出率、诊断效能各项指标)以(%)表示，行χ2检验；多组间比较行方差分析；一致性检验结果以Kappa值表示，分别以数值在≥0.75、0.4～0.74、<0.4表示一致性良好、一般和较差。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种染色方式单独检测和联合检测与金标准的阳性检出情况

127例患儿中Calretinin染色检测阳性85例，S100免疫组化染色检测阳性87例，联合检测阳性90例，金标准检测阳性98例，见表1。

表1 两种染色方式单独检测和联合检测与金标准的阳性检出情况[n=127]

2.2 两种染色方式单独检测和联合检测与金标准阳性结果的比较

Calretinin染色阳性率66.93%、S100免疫组化染色阳性率68.50%、联合检测阳性率70.87%、金标准检测阳性率77.17%，4种检测方式对比无统计学意义(χ2=3.730，P=0.292)，见表2。

2.3 两种染色方式单独检测和联合检测诊断效能比较

联合检测的特异性、敏感性、阳性预测值、阴性预测值均高于Calretinin染色和S100免疫组化染色，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 两种染色方式单独检测和联合检测诊断效能比较[%]

2.4 两种检测方式联合检测与金标准在扩张段和狭窄段检出情况的一致性和符合率

联合检测和金标准检测均为阳性的86例患儿中，联合检测检出扩张段55例、狭窄段31例；金标准检出扩张段59例，狭窄段27例，两者对比Kappa值0.844，一致性良好，符合率为93.02%(80/86)，见表4。

表4 两种检测方式联合检测与金标准在扩张段和狭窄段检出情况的一致性和符合率[n=86]

3 讨论

经临床研究发现[5]，在HD患儿的诊断中病理诊断结果有着至关重要的作用。目前，临床对于HD的病理学诊断最常见的方式乙酰胆碱酯酶染色，该方式在临床诊断中不仅具有取材较少的优势，还可以直接显现HD直肠黏膜固有层腺体间存在胆碱能纤维增生的情况，具有极高的诊断特异性；但该方式对待检组织的新鲜程度有着较高的要求，且检测时间较长，费用较高[6]。因此对于HD的诊断还需寻找更加客观、有效的辅助诊断方式。Calretinin属于钙结合蛋白，以阳性表达形式广泛存在于巨结肠扩张段神经节细胞区域，但在狭窄段则以阴性表达为主；而S100蛋白属于天冬氨酸蛋白酶，经免疫组化染色后在HD狭窄段黏膜下层粗大的神经纤维中呈阳性表达[7]。对此有专家学者提议可将两者联合检测用于HD的诊断。

经本研究发现，以乙酰胆碱酯酶染色为金标准，Calretinin和S100蛋白免疫组化染色联合检测的特异性86.21%、敏感性87.76%、阳性预测值95.56%、阴性预测值67.57%，均高于Calretinin染色单独检测的特异性51.72%、敏感性72.45%、阳性预测值83.53%、阴性预测值35.71%以及S100蛋白免疫组化染色的特异性58.62%、敏感性76.53%、阳性预测值86.21%、阴性预测值42.50%(均P<0.05)，由此可见，两种染色方式联合诊断HD的诊断效能更高。究其原因可以发现，Calretinin具有缓冲胞质内钙离子浓度的作用，属于周围神经系统细胞内和中枢神经系统细胞内的重要活性物质，对神经具有一定的保护作用，将其用于HD患儿的诊断可在巨结肠扩张段神经节细胞区域多呈阳性表达，而在狭窄段的神经节细胞缺失区域多呈阴性表达；而S100蛋白属于神经胶质细胞标志物，也广泛存在于神经纤维中，对在神经节细胞中却不见其表达，故而可借助对神经胶质细胞和神经纤维进行免疫组化特异性染色来进行判断，结果显示，不同发育程度和粗细的神经纤维会呈现不同的表达，比较特殊的是在巨结肠扩张段神经节细胞区域发现空泡状表现，在狭窄段神经节细胞缺失区域可见强阳性表达的增粗神经纤维[8]。因此，将两种方式联合检测用于诊断HD可以充分发挥彼此的优势，提高诊断效能。

与此同时，本研究发现，联合检测在扩张段病变组织和狭窄段病变组织方面检出情况与金标准相比Kappa值为0.844，符合率为93.02%，由此可见，联合检测与金标准之间具有较高的一致性和符合率。经研究发现，在HD病理诊断过程中，时常可见无神经节细胞检出的情况，而进一步明确是神经节细胞密度过低还是狭窄段神经节细胞缺失需多次进行切片检查，无形之中增加病理科工作人员的工作量[9]。另外，鉴于新生儿肠壁神经节发育的特殊性，其肠黏膜下层的神经节细胞多为不成熟的神经细胞，加之神经节密度较低、取材的不足，更易发生漏诊或误诊的情况。而在本研究中通过分段取材的方式，可以充分避免取材不足现象的发生，而联合采用两种染色方式可以有效避免将扩张段的诊断结果误诊为狭窄段的诊断结果，最大限度的弥补彼此在取材深度和取材位置方面的不足，从而有效提高临床诊断的准确性[10]。

综上所述，在新生儿HD诊断中Calretinin和S100免疫组化染色检联合检测的诊断效能高于两种染色方式单独检测的诊断效能，并且联合检测在扩张段和狭窄段的检出情况与金标准有较高的一致性和符合率，临床诊断价值颇高。但本研究仍存一定的不足之处，除研究样本容量较少以外，未对确诊患儿和未确诊患儿之间的染色结果进行对比，忽视慢性炎症等其他疾病对诊断结果的影响，因此在今后的研究中还需进一步扩大样本容量，完善研究方案，深入探索Calretinin和S100免疫组化染色检联合检测在HD患儿中的诊断价值。